水貂犬瘟热、细小病毒性肠炎二联灭活疫苗制备及其质量评价

罗国良，钟伟，易立，王振军，冯二凯，刘志杰，焉石，刘钰伦，刘伟，姜秋杰，董清平，李斌茹，程悦宁※

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112；2.长春西诺生物科技有限公司，吉林 长春 130012；3.吉林省动物疫病预防控制中心，吉林 长春 130062；4.肈源县畜牧水产技术服务中心，黑龙江 大庆 166500；5.刘台庄畜牧兽医中心站，河北 秦皇岛 066600）

水貂犬瘟热是引起水貂以双相热、白细胞减少、鼻炎和黏膜炎为特征的传染病[1,2]。水貂病毒性肠炎是以出血和坏死、急剧下痢和白细胞高度减少为特征的急性病毒性传染病[3,4]。水貂犬瘟热和水貂细小病毒性肠炎是危害养貂业的两大传染病，两种传染病在养貂业中均有较高的发病率和死亡率。疫苗免疫接种是目前预防这两种传染病的最有效的方法。目前，预防两种传染病的疫苗有水貂犬瘟热活疫苗、水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗、水貂犬瘟热、细小病毒性肠炎二联活疫苗以及水貂犬瘟热活疫苗与水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗联用疫苗[5]。联苗具有“一针多防”、减少免疫次数和提高接种效率等优点。活疫苗在实际应用中存在出现毒株变异和毒力返强等风险，不利于传染病的清除与净化[6]，因此，研制出一种水貂犬瘟热和水貂细小病毒性肠炎二联灭活疫苗对于该病的预防和净化具有重要意义。

本研究采用免疫原性良好的犬瘟热株CDV-LG株和水貂细小病毒MEVB 株，分别接种于Vero 细胞和猫肾传代细胞（F81 株）培养，收获细胞培养液经二乙烯亚胺（BEI）灭活后，加氢氧化铝胶制成，经性状检验、无菌检验和安全检验，证明该二联灭活疫苗对水貂具有良好的安全性；同时采用血清学方法和免疫攻毒方法进行效力检验，证明该产品具有良好的免疫效果，能抵抗犬瘟热强毒和水貂细小病毒强毒的攻击。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与细胞 犬瘟热CDV-LG 株（保藏编号GCMCC NO.17989）、水貂细小病毒MEVB 株均由中国农业科学院特产研究所特种动物病原与免疫团队保存鉴定；F81 细胞、Vero 细胞均由中国农业科学院特产研究所特种动物病原与免疫团队保存鉴定。

1.1.2 主要试剂 MEM培养基、0.25%胰酶-EDTA消化液（Corning公司）；2-溴乙胺氢溴酸盐（BEA）（Sigmaaldrich 公司）；其他试剂为国产分析纯。

1.1.3 实验动物 水貂购自吉林市昌邑区景文毛皮动物养殖场。50日龄以上水貂，公母随机，体况健康且未免疫水貂犬瘟热疫苗和水貂细小病毒性肠炎疫苗，免疫前经采血检测，犬瘟热病毒中和抗体和水貂细小病毒HI 抗体均为阴性（≤1:4）。

1.2 方法

1.2.1 犬瘟热病毒液的制备与检验 从生产细胞库中取出冻存的138 代Vero 细胞，置于37 ℃水浴中融化，接入到含6%～8%新生牛血清的MEM 细胞培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2 培养箱中培养，24 h 后换液培养2～3 d 至细胞长成致密单层，用含0.25%的胰酶消化，按1:3～1:5 传代，扩大培养。将扩大培养的细胞接种到转瓶中，37 ℃培养48～72 h，控制转速为8～12 r/h。将生产用毒种按MOI 为0.04～0.08 接种犬瘟热病毒CDV-LG 株于制备好的Vero 细胞悬液转瓶中，将细胞悬液与毒种混合均匀后置于33～35 ℃、8～10 r/h 条件下旋转培养，连续观察4d，废弃污染或生长异常的细胞，当病变达到80%以上时收获，收获的病毒液-18 ℃以下冻存备用。按以上方法制备3 批犬瘟热病毒液，进行无菌检验和病毒含量测定。

1.2.2 水貂细小病毒液的制备与检验 从生产细胞库中取出冻存的57 代F81 细胞，置于37 ℃水浴中融化，接入到含8%～10%新生牛血清的MEM 细胞培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2 培养箱中培养，24 h 后换液培养2～3 d 至细胞长成致密单层，用含0.25%的胰酶消化，按1:3～1:5 传代，扩大培养，将扩大培养的细胞接种到转瓶中，37℃培养48～72h，控制转速为8～10r/h。将F81 细胞消化后制备成细胞悬液，按1:3～1:5 分瓶，按MOI 为0.05～0.1 同步接种水貂细小病毒MEVB株生产毒种，33～35 ℃、8～10 r/h 转动培养3～5 d，每日观察病变情况，当病变率达80% 以上时收获，冻融后即为水貂细小病毒液，收获的病毒液-18 ℃以下保存备用。按以上方法制备3 批水貂细小病毒液，进行无菌检验和病毒含量测定。

1.2.3 半成品的制备与检验 将检验合格的犬瘟热病毒液、水貂细小病毒液分别融化后，分别加入终浓度为0.002 mol/L 的BEI，充分混匀，置于30 ℃下灭活24 h，灭活期间应不断搅拌。灭活后分别加入终浓度为0.002 mol/L 的硫代硫酸钠中和BEI，即得两种病毒液的半成品。

分别取灭活的犬瘟热病毒液和水貂细小病毒液，用细胞培养基1:5 稀释后分别吸附接种Vero细胞、同步接种F81 细胞各2 瓶，每瓶0.5 mL，培养4 d 后分别再传1代，观察细胞有无病变，收获传代后的水貂细小病毒的培养液，进行红细胞凝集试验，检测其血凝活性。

1.2.4 成品制备 将灭活的犬瘟热病毒液和水貂细小病毒液按1:1 的比例混合均匀，将混合病毒液与50%氢氧化铝佐剂按9:1 比例混合均匀，无菌定量分装，加盖密封，即得成品。按以上方法用3批半成品制备3批成品。

1.2.5 成品质量评价

1.2.5.1 性状 静置后，上层应为粉红色澄清液体，下层有少量乳白色沉淀，摇匀后应呈均匀混悬液。

1.2.5.2 无菌检验 按2020 版《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。

1.2.5.3 安全检验 选择50日龄以上健康易感水貂5 只，各肌肉注射疫苗5 头份（5 mL），分2～3 点注射，观察10 d，观察精神、食欲、体温、粪便与全身应无异常。

1.2.5.4 效力检验 血清学方法：选择50日龄以上健康易感水貂5 只，每只肌肉注射疫苗1 头份（1 mL），21 d 后采血，分离血清，按下列方法测定血清中犬瘟热病毒中和抗体和水貂细小病毒HI 抗体效价。

犬瘟热病毒中和抗体测定分别用100 TCID50 的犬瘟热病毒CDV-LG 株培养物与各试验水貂血清于37 ℃作用1 h，按2020 版《中国兽药典》附录测定血清中犬瘟热病毒中和抗体。

水貂细小病毒HI 抗体测定 分别用4 单位血凝素的水貂细小病毒MEVB 株培养物与各试验水貂血清于37℃作用1 h，按2020 版《中国兽药典》附录，测定各免疫水貂血清的HI 效价（1%猪红细胞）。

免疫攻毒法：犬瘟热免疫攻毒 选择50日龄以上健康易感水貂10 只（CDV中和抗体效价不高于1:4），分为疫苗组和对照组两组，疫苗组各皮下注射疫苗1头份（1 mL），对照组各皮下注射MEM 培养液1mL，接种21d后，每只水貂攻毒犬瘟热强毒CDV-HLJ17 株100 ID50（5mL），其中皮下注射犬瘟热强毒CDV-HLJ17 株病毒液4.5mL，滴鼻和点眼0.5 mL，观察14 d，观察是否有犬瘟热的典型症状及排毒；其中出现以下1 项及1项以上即判为出现典型症状：（1）体温升高达40 ℃以上；（2）出现结膜炎、干性或黏性眼眵；流清涕、黏性或脓性鼻涕；（3）精神沉郁、食欲减退或废绝。排毒检测应用犬瘟热抗原检测试纸检测发病动物血液、眼鼻分泌物，或死亡动物肺脏，呈现阳性即示为排毒；同时出现典型症状及排毒即判为发病，免疫组不出现典型症状和排毒中的任1 项，即判为保护。

犬细小免疫攻毒 选择50日龄以上健康易感水貂10 只（MEV HI 抗体效价不高于1:4），分为疫苗组和对照组两组，疫苗组各皮下注射疫苗1 头份（1 mL），对照组各皮下注射MEM 培养液1 mL，接种21 d 后，每只水貂攻毒（灌服）水貂细小病毒强毒MEV-SD16株100 ID50（10 mL），观察10 d，观察是否有水貂细小病毒典型症状及排毒；其中出现以下1 项及1 项以上即判为出现典型症状：精神沉郁、萎靡；食欲减退或废绝；软便、稀便、水样便或血便。排毒检测应用猪红细胞血凝试验检测攻毒水貂肛拭子，肛拭子对猪红细胞凝集试验血凝价不低于1:256，判定为排毒；同时出现典型症状及排毒即判为发病，免疫组不出现典型症状和排毒中的任1 项，即判为保护。

2 结果

2.1 犬瘟热病毒液制备与检验结果

制备了3 批水貂犬瘟热病毒液，经检验，3 批水貂犬瘟热病毒液无菌检验合格，病毒含量均在106.50～106.80TCID50/mL，符合制定的质量标准（≥106.50/mL），且无明显的批间差异，见表1。

表1 水貂犬瘟热病毒液制备与检验结果Table 1 Preparation and testing results of the mink canine distemper virus

2.2 水貂细小病毒液制备与检验结果

制备了3 批水貂细小病毒液，经检验，3 批水貂细小病毒液无菌检验合格，病毒含量均在106.80～107.20TCID50/mL，均符合质量标准（≥106.50TCID50/mL）。且批间无明显差异，见表2。

表2 水貂细小病毒液制备与检验结果Table 2 Preparation and testing results of the mink enteritis virus

2.3 半成品制备与检验结果

灭活了3 批犬瘟热病毒液和3 批水貂细小病毒液，经灭活检验，两种6 批病毒液均灭活完全。具体结果见表3。

表3 水貂犬瘟热、细小病毒肠炎二联灭活疫苗半成品制备与检验结果Table 3 Preparation and testing results of the semi-finished product test of mink canine distemper and parvovirus enteritis inactivated vaccine

2.4 水貂犬瘟热、细小病毒性肠炎二联灭活疫苗成品制备与检验

采用检验合格的半成品，配制了3 批水貂犬瘟热、细小病毒性肠炎二联灭活疫苗，经性状、无菌和安全检验均符合要求，结果见表4。

表4 水貂犬瘟热活疫苗、细小病毒性肠炎二联灭活疫苗制备与检验结果Table 4 Preparation and testing results of the mink canine distemper and parvovirus enteritis inactivated vaccine

2.5 水貂犬瘟热、细小病毒性肠炎二联灭活疫苗效检结果

3 批疫苗经免疫水貂21 d 后，采血检测犬瘟热病毒中和抗体及水貂细小病毒HI 抗体，结果见表5。

表5 水貂犬瘟热、细小病毒肠炎二联灭活疫苗免疫抗体检测结果Table 5 Immune antibody results of mink canine distemper and parvovirus enteritis inactivated vaccine

3 批疫苗经免疫水貂21 d后，与对照组同时进行攻毒试验，攻毒后观察各试验水貂发病情况，具体结果见表6。

表6 水貂犬瘟热、细小病毒肠炎二联灭活疫苗免疫攻毒试验结果Table 6 Results of challenged with virulent CDV & MEV strain after immuning by the mink canine distemper and parvovirus enteritis inactivated vaccine

3 结论与分析

细小病毒具有进化变异迅速、感染谱广等特点[7]，细小病毒活疫苗存在变异和跨宿主感染的风险。大量的研究及临床使用已证明，水貂细小病毒采用灭活疫苗进行免疫具有优良的安全性和良好的免疫效果[8]，在我国的养貂业中水貂细小病毒灭活疫苗的使用对于防制水貂细小病毒的暴发和流行起到重要的作用。为预防犬瘟热，最先使用的是灭活疫苗，但在当时传统的工艺水平条件下，犬瘟热灭活疫苗的免疫效果不理想，从而逐渐被弱毒疫苗所代替，然而弱毒疫苗不仅对某些动物安全性差，而且毒力不稳定，存在变异返祖风险[9,10]。同时，联苗具有使用便捷、“一针多防”等优点，因此，本研究采用灭活联苗方案，在充分保证安全性的前提下，兼具使用便捷性，为了提高其免疫效果，在保证足量抗原的同时，采用BEI 进行灭活，最大限度保证抗原蛋白的空间构象和抗原决定部位可接近性[11,12]，确保了抗原蛋白的免疫原性，在此基础上，加入经长期实践证明对水貂具有良好安全性并具备较好免疫增强效果的氢氧化铝佐剂[13]，来提升该二联灭活疫苗的免疫效果。

本研究进行了3 批水貂犬瘟热、细小病毒性肠炎二联灭活疫苗的实验室试制，对3 批产品生产中的病毒液、半成品及成品进行了检验，结果表明，3 批产品的各项检验指标符合制订的标准且工艺稳定，可进一步放大进行中试生产；采用血清抗体测定和免疫攻毒方法对其进行效力评价，结果显示，免疫接种21 d，水貂犬瘟热中和抗体可达1:51～1:91，水貂细小病毒HI抗体可达1:64～1:256，经免疫攻毒，可抵抗100 ID50 的犬瘟热强毒和水貂细小病毒强毒的攻击，具有较好的免疫效果，可进一步开展临床试验。