水蛭提取液通过VEGF/PI3K/AKT通路抑制WERI-RB-1细胞表达VEGF

李园媛，郑燕林，李建超，惠延年，马士航，黄 慧，王 芳，马宏杰

0引言

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是3岁以下婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，也可见于年长的儿童甚至成年人[1-3]。肿瘤早期局限于眼球内，随病程进展可发生眼外转移甚至致命[4]。近30a来，RB的治疗取得明显进展，静脉化学药物疗法、眼动脉超选介入化疗等可以保留患眼，但存在明显的副作用[5]。寻求更有效、安全的药物或生物疗法是必要的。

RB细胞可分泌多种生长因子，如血管内皮生长因子(VEGF)。研究发现，VEGF蛋白在RB细胞中呈高表达[6]，VEGF是RB研究中最彻底和广泛被探索的促血管生成因子，在调节肿瘤血管生成和转移中起重要作用[7-10]。另有研究发现，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)信号通路调控与增殖、转化、存活、迁移、血管生成相关的多种因子，包括基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、缺氧诱导因子-1a(HIF-1a)[11-13]。有报道称，PI3K信号通路可被包括VEGF在内的多种生长因子激活[14-15]。PI3K/AKT信号通路激活后，下游靶基因HIF-1a被激活，调节刺激血管生成基因的转录，如VEGF和MMP-9[16-19]。HIF-1a、MMP-9在肿瘤细胞侵袭中具有特殊作用，二者可通过多种信号作用方式相互调节[20-21]。机体缺氧时，组织缺氧释放大量的MMP-9，从而促使MMP-9信号通路相关因子的表达增加，即HIF-1a上调MMP-9的表达。阻断HIF-1a/MMP-9信号通路可促进肿瘤无功能血管的发生，这些无功能血管不能有效输送肿瘤生长所需的氧气和营养物质，达到延缓和抑制肿瘤生长的目的[22-25]。因此，VEGF/PI3K/AKT、HIF/MMP-9等信号通路为靶点的研究可作为抑制RB的重点。然而，目前关于VEGF/PI3K/AKT、HIF/MMP-9信号通路在RB中的研究较少，其作用仍需进一步探索。前期研究发现，水蛭提取物具有抑制成纤维细胞增生的作用[26]，水蛭提取液可有效抑制人视网膜母细胞瘤细胞WERI-Rb-1细胞系增殖和侵袭，并诱导细胞凋亡[27]。因此，本研究通过VEGF/PI3K/AKT通路及相关因子，丰富和完善水蛭提取液对视网膜母细胞瘤细胞增殖、凋亡和侵袭作用的影响，为其潜在的治疗作用提供理论基础。

1材料和方法

1.1材料WERI-RB-1细胞(中国科学院上海生命科学研究院，No.3131C0001001200012)。水蛭干粉(兰州安泰堂中药饮片公司；生产批号：14082702；GMP证书号：甘J0071；水蛭提取液提取方法及浓度选择参考文献[26])；Human VEGF Elisa试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；总RNA抽提试剂TRIZOL、PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Kit、HIF-1a、MMP-9鼠单克隆抗体(美国Santa公司)； 预染蛋白Marker(美国NEB公司)；ECL发光试剂盒(美国Thermo公司)；PVDF膜(美国Hybond公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(南京凯基生物公司)。RT-PCR仪(美国Thermo Fisher公司)；垂直电泳槽、DYY-6C电泳仪、Image Lab凝胶分析系统(美国Bio-rad 公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养WERI-RB-1细胞从液氮容器中快速取出，提前备好约50℃无菌水，迅速解冻，2500g 20℃离心10min，丢弃上清液，加入2mL完全培养基RPMI-1640重悬细胞，以适当密度接种到6孔板中，然后在恒温培养箱中培养。培养基每隔1天更换1次。待培养皿内细胞生长至70%～80%时以1∶2比例进行传代培养。

1.2.2实验分组及药物干预取对数生长期的WERI-RB-1细胞，以5×105cells/mL接种于6孔板中，每孔加入800μL细胞悬液，细胞培养箱中培养过夜后分3组，对照组加完全培养基，0.04U/mL水蛭提取液组、0.08U/mL水蛭提取液组分别加入含0.04、0.08U/mL的含药培养基，置培养箱培养48h。

1.2.3ELISA检测VEGF表达水平将试剂盒和样品(各组细胞培养基上清液)平衡至室温，样品分别用标本稀释液稀释(1∶100)，混合均匀后各取100μL加入到96板孔。设阴阳性对照各一孔组，同时设加入100μL标准通用稀释液作为空白对照孔，每组设6孔。37℃孵育60min。吸取孔内液体，用洗涤液连续洗涤3次，每次停留30s后吸取孔内液体，并在吸水纸上拍干，空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加生物素化抗体工作液(每孔100μL)，37℃孵育60min。用洗涤液连续洗涤3次，吸水纸上拍干。空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加酶结合物工作液(每孔100μL)，37℃孵育30min。每孔加入显色底物(TMB)100μL，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液100μL，混匀后即刻测量450nm处OD值。

1.2.4RT-PCR检测HIF-1a和MMP-9mRNA相对表达水平收集各组细胞，分别加入1mL TRIZOL，充分匀浆、萃取RNA。逆转录试剂盒逆转录合成cDNA。RT-PCR法检测HIF-1a和MMP-9 mRNA表达情况，配制20μL PCR 反应体系，反应条件： 95℃ 10min，95℃ 15s，58℃ 50s，58℃ 50s，45个循环，β-Actin 为内参基因，使用Thermo Scientific PikoReal软件(Thermo公司)分析各检测样本的CT值，并通过2-△△CT法计算目的基因相对表达水平。所有样本重复检测3次，取平均值。引物序列见表1。

1.2.5WesternBlot检测HIF-1a、MMP-9、PI3K、p-AKT蛋白相对表达水平收集各组细胞，裂解提取蛋白，BCA 法进行蛋白定量，35μg样本蛋白混合等体积上样，电泳后转移至PVDF膜，封闭液封闭，室温孵育2h，加入PI3K(1∶800)、p-AKT(1∶500)、HIF-1a(1∶500)、MMP-9(1∶800)一抗，4℃过夜，TBST洗膜3次，每次10min，加入二抗(1∶10000)，室温孵育45min，显色，并采用LabWorks软件分析蛋白条带灰度值，以目的条带与内参条带β-Actin比值表示目的蛋白的表达水平，计算p-AKT、PI3K、HIF-1a及MMP-9蛋白相对表达量。

2结果

2.1水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达VEGF的影响ELISA检测结果显示，对照组、0.04U/mL水蛭提取液组、0.08U/mL水蛭提取液组细胞培养基上清液中VEGF表达差异有统计学意义(F=93.4，P<0.05)，且水蛭提取液组均低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。0.04、0.08U/mL水蛭提取液对VEGF表达的抑制率分别为32.43%、38.92%。

图1 ELISA检测VEGF蛋白的表达 aP<0.05，bP<0.01 vs 对照组。

2.2水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达HIF-1a和MMP-9mRNA的影响RT-PCR检测结果显示，对照组、0.04U/mL水蛭提取液组、0.08U/mL水蛭提取液组细胞HIF-1a和MMP-9 mRNA的相对表达水平差异均有统计学意义(F=36.7、74.5，均P<0.05)，且水蛭提取液组均低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。0.04、0.08U/mL水蛭提取液对HIF-1a mRNA表达的抑制率分别为27.64%和24.75%，对MMP-9 mRNA表达的抑制率分别为43.97%和51.48%。

图2 RT-PCR检测HIF-1a和MMP-9 mRNA的表达 A：HIF-1a；B：MMP-9。aP<0.05，bP<0.01 vs 对照组。

2.3水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达PI3K和p-AKT蛋白的影响Western Blot检测结果显示，对照组、0.04U/mL水蛭提取液组、0.08U/mL水蛭提取液组细胞PI3K、p-AKT蛋白表达水平差异均有统计学意义((F=51．8、70.4，均P<0.05)，且水蛭提取液组均低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。0.04、0.08U/mL水蛭提取液对PI3K蛋白表达的抑制率分别为33.27%、29.83%，对p-AKT蛋白表达的抑制率分别为52.07%、30.21%。

图3 Western Blot检测PI3K和p-AKT蛋白相对表达水平 A：Western Blot检测结果；B：PI3K蛋白相对表达水平；C：p-AKT蛋白相对表达水平。aP<0.05，bP<0.01 vs 对照组。

2.4水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达HIF-1a和MMP-9蛋白的影响Western Blot检测结果显示，对照组、0.04U/mL水蛭提取液组、0.08U/mL水蛭提取液组细胞HIF-1a、MMP-9蛋白表达水平差异均有统计学意义(F=66.2、80.9，均P<0.05)，且水蛭提取液组均低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4。0.04、0.08U/mL水蛭提取液对MMP-9蛋白表达的抑制率分别为39.49%、47.23%，对HIF-1a蛋白表达的抑制率分别为55.81%、43.85%。

图4 Western Blot检测MMP-9和HIF-1a蛋白相对表达水平 A：Western Blot检测结果；B：MMP-9蛋白相对表达水平；C：HIF-1a蛋白相对表达水平。aP<0.05，bP<0.01 vs 对照组。

3讨论

本研究首先观察水蛭提取液处理WERI-RB-1细胞后VEGF的表达情况，通过ELISA分析发现，0.04、0.08U/mL水蛭提取液处理WERI-RB-1细胞48h后，VEGF表达被抑制，0.04、0.08U/mL水蛭提取液对VEGF表达的抑制率分别为32.43%、38.92%，呈现剂量依赖趋势。李先建等[28]关于水蛭素对肝癌细胞HepG2的抑制作用及其分子机制的研究发现，水蛭素能抑制肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭，其机制可能是通过下调VEGF表达。诸佳瑜[29]研究水蛭含药血浆、血清对人胰腺癌PANC-1细胞的影响，结果表明水蛭含药血浆、血清对人胰腺癌PANC-1细胞具有抑制增殖、迁移及抑制VEGF表达的作用。上述研究结果与本研究结果一致。本研究采用RT-PCR法检测经0.04、0.08U/mL水蛭提取液处理的WERI-RB-1细胞中MMP-9和HIF-1a mRNA相对表达水平，采用Western Blot法检测细胞中MMP-9和HIF-1a蛋白及PI3K/AKT信号通路相关蛋白PI3K和p-AKT蛋白的相对表达水平。结果显示，与对照组比较，水蛭提取液干预下细胞HIF-1α和MMP-9 mRNA相对表达水平下降，HIF-1a、MMP-9、PI3K和p-AKT蛋白相对表达水平均降低。张景容等[30]研究水蛭素对特发性肺间质纤维化病的影响，结果发现水蛭素能降低模型小鼠肺中AKT、p-AKT蛋白的表达量。另有研究发现，雷帕霉素可通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制RB细胞增殖，促进细胞凋亡[31]。

此外，本研究结果表明，水蛭提取液可能通过抑制WERI-RB-1细胞表达VEGF降低VEGF下游PI3K的表达，抑制p-AKT活性，进一步抑制下游靶基因HIF-1a和MMP-9的表达，从而抑制RB血管生成和肿瘤生长。其次，水蛭提取液可能直接抑制了HIF-1a的表达，进一步抑制下游靶基因VEGF和MMP-9的表达，而VEGF又抑制了PI3K/AKT通路的活性，从而发挥抑制肿瘤血管生成和生长的作用。此外，水蛭提取液也可能直接抑制MMP-9的活性，进而抑制MMP-9对WERI-RB-1细胞外基质(ECM)的降解，从而抑制VEGF从ECM中释放，并在一定程度上抑制VEGF-VEGF受体的相互作用，最终抑制PI3K/AKT通路的活性，抑制RB血管生成和转移。既往研究观察水蛭素对化疗诱导的周围神经病变(CIPN)的影响发现，水蛭素可明显减轻奥沙利铂(L-OHP)化疗副作用，显著抑制L-OHP诱导的CIPN小鼠体内p38、HIF-1的过表达和MMP-9/2的活化，达到改善CIPN的作用[32]。另有研究观察水蛭素对急性肺损失大鼠的影响发现，水蛭素可减少大鼠体内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和MMP-12的释放，推测水蛭素可抑制肺损伤引起的炎症和纤维化，并作为抗炎介质在肺保护中发挥作用[33]。因此，初步推测，水蛭提取液可能通过VEGF/PI3K/AKT信号通路和HIF-1a、MMP-9因子发挥抑制RB的作用，这为水蛭提取液的抗肿瘤作用机制提供了新的见解。然而，本研究的局限性和不足在于采用的药物干预剂量分组较少，且0.04U/mL水蛭提取液的干预剂量对HIF-1a、PI3K和p-AKT的抑制作用强于0.08U/mL水蛭提取液，后期研究应进一步缩小剂量之间的跨度，设置更多剂量组，寻找最佳的药物干预剂量。此外，由于时间和经费限制，本研究观察时间点较少，不能够显示动态的量效、时效曲线，同时缺少阳性对照，未进行刺激、抑制信号通路的实验证实相关通路的作用，后期研究将力争进一步完善。

表1 引物序列

综上所述，水蛭提取液可能通过VEGF/PI3K/AKT信号通路介导的信号及抑制MMP-9和HIF-1a的表达抑制RB的发生发展，提示VEGF/PI3K/AKT可能是水蛭提取液在RB治疗中的一个有前途的靶点。虽然该结论还需要进一步完善和验证，如进行动物实验/体内试验等，但本研究结果为目前研究RB提出了新的兴趣点和潜在的研究价值。