鸡源缓慢葡萄球菌的分离鉴定与耐药性分析

李 涛，陈 广，温贵兰，刘蔓蔓，张小波，曾熙雯

(1.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550025；2. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025 ；3. 贵州省动物生物制品工程技术研究中心，贵州 贵阳 550016)

缓慢葡萄球菌(Staphylococcuslentus)属于微球菌科、葡萄球菌属，是一种凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negativeStaphylococci,CNS)，最早由Kloos等[1]命名。目前，缓慢葡萄球菌使动物致病的报道越来越多[2-6]，但关于禽源缓慢葡萄球菌的报道较为罕见。2019年12月，贵州省某养殖场麻黄鸡出现死亡，病鸡临床症状表现为面部肿胀，剖检主要病变为心脏纤维素性渗出、心包积液等。本试验从病鸡中分离出1株革兰阳性球菌，经病原形态观察、生化试验和16S rRNA鉴定为缓慢葡萄球菌，并对其进行药敏试验、耐药基因检测、动物回归试验，为临床禽类防控缓慢葡萄球菌病提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料及试验动物 2只患病麻黄鸡源自贵州某养殖场；16只SPF级昆明小鼠，购自贵州医科大学实验动物中心；16只1日龄麻黄鸡，购自贵州大学科研鸡场。

1.2 主要试剂 固体琼脂培养基、液体培养基、鲜血琼脂培养基、革兰染料、药敏纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司；2×EsTaqDNA聚合酶，购自康为世纪有限公司；DL-2 000 Marker、DL-5 000 Marker，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物设计与合成 参照参考文献[7-10]合成细菌16S rRNA引物和耐药基因引物，检测的耐药基因包括大环内酯类erm(B)、erm(C)，喹诺酮类oqx(A)，四环素类tet(B)，磺胺类sul1，β-内酰胺类blaTEM、blaVIM。引物序列见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 细菌分离纯化及形态观察 无菌环境下取病鸡的肝脏、心脏、眶下窝和腹腔积液在鲜血琼脂平板上进行细菌分离培养，将血平板分成2个组，分别置于37 ℃培养箱培养12 h和37 ℃烛缸培养12 h。染色镜检后进行纯化，纯化后取单个菌落于液体培养基培养12 h。

1.5 生化试验 挑取纯培养后的单菌落接种于16种常见生化管(表2)，37 ℃培养24～48 h后记录结果。血浆凝固酶试验：在2块玻片上均加100 μL的新鲜兔血浆，然后分别加入等量的待测菌液和PBS，混合1 min后记录结果。

1.6 16S rRNA序列分析 使用1.3中16S rRNA引物进行PCR扩增。PCR反应产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，阳性产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.7 药敏试验 挑取分离纯化后单菌落于37 ℃摇菌12～16 h，取100 μL菌液用无菌涂布棒均匀涂抹于LB固体培养基中，用纸片法将药敏纸片紧贴于平板上，37 ℃培养24 h，记录药敏纸片的抑菌圈直径，参照美国临床和实验室标准化协会 (CLSI 2016) 抗微生物药物敏感试验标准进行分离菌药物敏感性判断。

1.8 耐药基因检测 使用1.3中合成的耐药基因引物对分离菌进行PCR检测。反应产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.9 动物致病性试验 挑取纯化后的单菌落摇菌24 h，使用平板菌落计数法计算出原始菌液中所含菌落总数为5.8×108CFU/mL。将小鼠分为4个组，每组4只，将菌液用灭菌PBS稀释成5.8×108、5.8×107CFU/mL和5.8×106CFU/mL，分别注射于3个试验组的小鼠，每只腹腔注射0.5 mL菌液，对照组腹腔注射等体积的灭菌PBS。连续观察7 d，记录对照组和试验组小鼠情况。雏鸡致病性试验同小鼠致病性试验。

2 结果

2.1 细菌分离纯化及形态观察 从病鸡内脏分离到形态均一菌落，且需氧培养比厌氧培养生长状态好，鲜血琼脂平板上可见乳白色、表面凸起、边缘整齐的菌落。革兰染色镜检可见葡萄串状的球菌，将分离菌株命名为GZSL20191203。

2.2 生化试验 GZSL20191203尿素等12种反应阳性，木糖醇等4种反应阴性，血浆凝固酶试验阴性，结果如表2所示。

表2 GZSL20191203生化试验

2.3 16S rRNA序列分析 对分离菌进行16S rRNA PCR扩增，结果在1 450 bp左右出现条带(图1)。经测序获得大小为1 439 bp的序列，将序列与GenBank下载的参考菌株16S rRNA基因序列进行同源性比对，发现GZSL20191203与下载的6株缓慢葡萄球菌的16S rRNA同源性均≥99.8%，与黑龙江分离株CICCHLJ Q29亲缘关系最远，为99.8%，与伊朗分离株HM17亲缘关系较近，为100%(图2)。用生物学软件Megalign对测序所得16S rRNA序列绘制遗传进化树，结果显示GZSL20191203与缓慢葡萄球菌处于同一分支(图3)。

图1 16S rRNA基因的PCR扩增

图2 GZSL20191203 16S rRNA基因序列核苷酸同源性分析

图3 GZSL20191203 16S rRNA基因序列系统进化树

2.4 药敏试验 选取28种药敏纸片进行药敏试验，GZSL20191203对羧苄西林等21种抗菌药耐药，对头孢氨苄等5种抗菌药中度敏感，对头孢哌酮和头孢唑啉敏感(表3)。结果表明GZSL20191203耐药性较高。

表3 GZSL20191203药敏试验

续表

2.5 耐药基因检测 GZSL20191203耐药基因PCR检测结果见图4，大环内酯类erm(B)、erm(C),β-内酰胺类blaVIM、blaTEM,四环素类tet(B),磺胺类sul1耐药基因呈阳性。

图4 GZSL20191203耐药基因的PCR扩增

2.6 动物致病性试验 攻毒12 h后试验组小鼠精神沉郁、呆立不动、畏寒、腹式呼吸，这与苏接瑜等[5]缓慢葡萄球菌小鼠致病性试验结果一致，而对照组小鼠精神相对较好；之后试验组小鼠精神逐渐好转，攻毒后7 d，精神恢复正常。雏鸡按同样方法同等剂量腹腔接种缓慢葡萄球菌，同样观察7 d，试验组雏鸡也未发生死亡。但试验组雏鸡生长缓慢，与对照组相比体重差异明显，其中5.8×108CFU/mL接种量的雏鸡差异最为明显。结果表明GZSL20191203正常情况对小鼠和雏鸡无致病性。

3 讨论

目前，CSN被认为与人类和动物各种机会性感染有关[11]。缓慢葡萄球菌作为CSN的一种，随着致病的报道增多而备受关注。2010—2019年，先后报道了缓慢葡萄球菌致仓鼠[3]、猪[4]、眼镜蛇[5]、水貂[6]发病。但鸡感染缓慢葡萄球菌的报道罕见，本试验从病鸡的心脏、肝脏、肾脏、眶下窝和腹腔积液分离到缓慢葡萄球菌，证实病鸡确有缓慢葡萄球菌感染。Wos-Oxley等[12]发现，人的前鼻孔经常被凝固酶阴性葡萄球菌定殖，眼结膜表面也常常被CNS定殖[13-14]。本试验中病鸡头面部肿胀也与缓慢葡萄球菌定殖于动物眼结膜和鼻孔有关。

GZSL20191203对红霉素等耐药，能检测到erm(B)等耐药基因。虽然大环内酯类、四环素类和β-内酰胺类药敏试验与耐药基因检测结果一致；但喹诺酮类药敏试验与耐药基因检测结果不同，说明耐药表型与耐药基因型没有严格的一一对应的联系。这可能与基因的表达状态以及在抗菌药的选择压力下细菌产生抗性机制的多样性等多种因素有关[15]。魏文娟等[16]研究也表明，一些耐药菌株不携带耐药基因可能是因为存在其他耐药机制。已有文献表明，葡萄球菌可以共享许多抗药性基因[17-18]，因此GZSL20191203携带的耐药基因可能会在环境中扩散，造成其他物种耐药性增加。细菌耐药机制有很多，包括耐药基因和整合子介导的耐药机制[19]，GZSL20191203检测出β-内酰胺类耐药基因blaTEM、blaVIM，说明该菌株能够使β-内酰胺类抗菌药失活或产生低亲和力而耐药。Bhargava等[20]从牛、山羊、绵羊、猪和鸡分离的缓慢葡萄球菌中检测出大环内酯类耐药基因erm(A)、erm(B)、erm(C)，GZSL20191203也与此相符。这些研究都表明缓慢葡萄球菌有较高的耐药性，并且可以作为贮存库传播给其他葡萄球菌，使得其他葡萄球菌耐药性升高。本试验成功分离到1株缓慢葡萄球菌，并对其进行耐药基因PCR检测、小鼠和雏鸡致病性试验，发现分离株GZSL20191203是1株多重耐药的条件致病性缓慢葡萄球菌。