河北省2株鸭圆环病毒全基因组测序与遗传进化分析

李馨月，王文静，张宗淑，王 超，张 铁

(河北农业大学动物医学院，河北 保定 071000)

鸭圆环病毒(Duck circovirus，DuCV)作为圆环病毒科圆环病毒属的成员之一[1]，是一种无囊膜、二十面体对称的单股环状DNA病毒[2]。作为已知体型最小感染鸭的病毒[3]，DuCV主要引起感染鸭的法氏囊淋巴细胞减少、损伤、坏死，组织细胞增生等现象[4-5]。DuCV轻则会导致感染鸭脱毛，重则会造成精神沉郁、呼吸困难、贫血、消瘦、营养不良等，甚至导致产蛋鸭的生产性能降低[6]。DuCV还能够直接破坏鸭的免疫系统[7]，造成免疫器官受损，体液免疫和细胞免疫功能显著降低，同时引起免疫抑制[8]，增加其与细菌或其他病毒混合感染和继发感染的可能性，使病鸭的死亡率升高。有研究表明，已经感染DuCV的鸭更容易患上鸭病毒性肝炎、鸭疫里氏杆菌病、鸭瘟、大肠埃希菌病等病症[9]。

DuCV最早于2003年被德国学者Hattermann等从番鸭的法氏囊组织中发现并报道[10]，2006年在我国台湾地区首次检测到DuCV感染[11]，而DuCV全基因序列在我国大陆地区的首次成功克隆则是在2008年[12]，随后山东、福建、浙江、四川、江苏、广东等地陆续有相关研究，但对于河北地区DuCV的研究尚不多见。近年来，随着DuCV的广泛流行，混合感染病例也逐渐增多。

本试验旨在通过分析2株临床获取的DuCV的全基因序列及遗传进化特点，了解河北省临床感染的DuCV毒株的基因型及遗传变异情况，以期为DuCV感染的实验室诊断和科学防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料 由河北省鸭场送检的48只以脱毛、生长迟缓为特征的病死鸭法氏囊，-80 ℃保存备用。

1.2 主要试剂 DH5α感受态细胞和病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司；pMD20-T Vector，购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA 2 000 Marker和SanPro 柱式DNA胶回收试剂盒，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×TaqPlus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)，购自诺唯赞生物科技(南京)股份有限公司。

1.3 主要仪器 生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，电泳仪(北京市六一仪器厂)，PCR仪(伯乐生命医学产品有限公司)，全自动凝胶成像仪(北京赛智创业科技有限公司)，台式恒温振荡器(上海精宏实验设备有限公司)，涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.4 试验方法

1.4.1 DNA提取 将处理好的样品，按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行操作，提取DNA。

1.4.2 引物设计与合成 根据GenBank中DuCV(登录号：KC460534)的全基因序列，应用Primer(Version 5.0)软件分析并设计特异性引物DuCV-F/R。参照李金丽[13]设计的引物DuCV-Q-(1～4)-F/R，用于DuCV全基因组核苷酸的扩增。引物序列见表1，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR引物

1.4.3 DuCV检测 以1.4.1中提取的DNA为模板，用DuCV-F/R引物进行PCR扩增。PCR反应体系(25 μL)：12.5 μL Mix，10 μL ddH2O，上、下游引物各0.5 μL，模板1.5 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共34个循环；72 ℃延伸5 min。扩增完成后，取5 μL PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统中观察并记录结果。

1.4.4 DuCV基因组全长的PCR扩增、克隆及测序 选取2株1.4.3中结果呈阳性的DNA为模板，用DuCV-Q-1-F/R、DuCV-Q-2-F/R、DuCV-Q-3-F/R、DuCV-Q-4-F/R共4对引物分别进行PCR扩增。PCR反应体系及PCR反应程序同1.4.3，退火温度根据Tm值改变。扩增完成后，取5 μL PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统中观察并记录结果。PCR产物纯化后连接到pMD20-T载体，转化DH5α感受态细胞，经蓝白筛选，挑取单个菌落于含氨苄抗性的LB液体培养基中过夜培养，提取质粒经PCR鉴定，将阳性质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.4.5 DuCV全基因组序列分析 将测序结果运用DNASTAR软件进行整理与拼接，获得2株DuCV全基因组序列。运用BLAST、DNAMAN和MEGA 7.0软件，将获得的2株DuCV全基因组序列与参考株基因组序列比对，进行同源性比较和基因进化树分析。本试验用于核酸序列分析的参考毒株见表2。

表2 用于基因序列比较的参考毒株

2 结果

2.1 DuCV检测 对48例病死鸭病料组织DNA样品进行PCR扩增，产物大小与目的片段预期大小相符(图1)，DuCV阳性率为72.92%(35/48)。

图1 部分DNA样品鸭圆环病毒的PCR检测

2.2 分段PCR扩增 PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，分段扩增的条带大小与目的片段预期大小相符(图2)。本试验成功扩增选取的2株DuCV的全基因序列，录入GenBank，登录号分别为MW255979和MW255980。MW255979全基因序列长为1 995 bp，与已报道的中国山东株GU131340和中国广西株KC460534长度一致；MW255980全基因序列长为1 993 bp，与已报道的中国北京株HM162348、中国山东株MF627688、中国广西株MK814578、韩国株JQ740360和中国台湾株KP229366长度一致。

图2 2株鸭圆环病毒分段PCR扩增

2.3 全基因组同源性比较 应用DNASTAR软件中的MegAlign进行同源性比较，结果如图3所示，2株DuCV基因序列的同源性为97.9%；2株DuCV全基因序列与14株国内外参考株序列同源性为82.9%～98.7%，可细分为2个数值段，一个为94.3%～98.7%，另一个为82.9%～83.4%；其中MW255979与中国广西株MK814578核苷酸同源性最高，为98.7%，与中国山东株EU022374和中国广西株JX241045核苷酸同源性最低，为83.0%；MW255980与韩国株JQ740360核苷酸同源性最高，为98.6%，与中国山东株EU022374核苷酸同源性最低，为82.9%。

图3 2株鸭圆环病毒和参考毒株基因核苷酸序列同源性比较

2.4 全基因组遗传进化分析 采用MEGA 7.0软件对获得的2株DuCV全基因序列与14株参考序列绘制遗传进化树，结果如图4所示，DuCV可以分为2个基因型，分别是以中国广西株MK814578为代表的DuCV-1型和以中国台湾株AY394721为代表的DuCV-2型。其中，DuCV-1型又可以分为2个亚型，MW255979毒株、MW255980毒株和中国北京株HM162348、中国山东株MF627688、中国广西株MK814578、中国广西株KC460528、韩国株JQ740360均属于同一亚型；MW255979株与中国广西株MK814578遗传距离最为接近，MW255980株与韩国株JQ740360遗传距离最为接近；MW255979和MW255980均属于DuCV-1型，与属于DuCV-2型的中国台湾株AY394721、中国山东株EU022374、中国广西株JX241045和中国福建株KF726087关系较远。

图4 DuCVs基因组系统进化树

3 讨论

本试验扩增得到的2株DuCV全基因组内均包括6个大于200 bp的开放阅读框(Open reading frames，ORFs)：位于正链的ORF V1、V2、V3，及位于负链的ORF C1、C2、C3。MW255979毒株：ORF V1(49～927 bp)、ORF V2(1 370～1 519 bp)、ORF V3(1 661～1 810 bp)、ORF C1(1 932～1 159 bp)、ORF C2(1 741～1 379 bp)和ORF C3(400～164 bp)。MW255980毒株：ORF V1(49～927 bp)、ORF V2(1 368～1 517 bp)、ORF V3(1 659～1 916 bp)、ORF C1 (1 930～1 157 bp)、ORF C2(1 739～1 377 bp)和ORF C3(400～134 bp)。

2株DuCV全基因序列的ORF V1编码氨基酸长度为292 aa的Rep蛋白，是与病毒复制有关的蛋白。在具有滚环复制特征的保守基序(50TPHLQGF56和91YCAKE95)和可启动滚环复制过程中酶促反应的dNTP结合域(14FTINNP19、167GPPGTGKSR175和206DDFYGW211)编码区内，2株DuCV均未出现核苷酸插入或缺失。位于圆环病毒负义链上的ORF C1编码长度为257 aa的Cap蛋白，作为病毒的核衣壳蛋白，其具有良好的免疫原性[14]。在2株DuCV基因组ORF V1的5′端和ORF C1的3′端之间均存在茎环结构，目前被认为是DuCV复制的起点。ORF V1的3′端与ORF C1的5′端之间存在1个由正向重复4次的碱基序列(下划线标记)组成的四重串联重复序列(QTR)：CACTTGGCAGGGTATTACACTTGG-GCAGCTCGG，推测其可能作为启动包装过程的信号。现有研究表明，OTR特异的存在于DuCV基因组中，在调节Rep和Cap的表达中有重要作用[15]。位于ORF V1的互补链上的ORF C3编码长度为79 aa的蛋白，是目前已知的DuCV唯一具有诱导细胞凋亡活性的病毒蛋白[16]。2株DuCV的ORF C3与属于DuCV-2型的中国台湾株AY394721、中国福建株KF726087、中国山东株EU022374和中国广西株JX241045的ORF C3具有显著差异，与报道相符合[17]，该研究还表明2个基因型ORF C3 C端的差异氨基酸序列对于ORF C3胞核定位与凋亡活性的调控有重要意义。

由于没有普遍适用的体外培养DuCV的方法，且对其致病机理仍不明确，尚未有商品化的疫苗出现，并且尚未发现有效治疗药物。目前对于DuCV的防治手段主要集中在预防层面，通过提高鸭群的饲养管理水平，增强鸭群的免疫能力。现有关于河北地区DuCV毒株的报道少之又少，对于DuCV基因组的分析研究主要集中于广西、山东等地，本试验通过对河北地区临床送检病料中选取的2株DuCV基因组进行测序，并进行遗传进化分析，发现获得的2株DuCV全基因序列与近年来我国大陆地区临床所获得的DuCV-1型毒株相比，基因型未发生明显突变，为进一步研究DuCV基因提供了数据支持。要更全面地了解河北地区DuCV流行的基因型现状，还需进一步扩大样品采集范围加以验证。