超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法同时测定舒眠胶囊（片）中4种黄曲霉毒素含量

陈 莉

（中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院药剂科，福建 福州 350000）

舒眠胶囊（片）由酸枣仁、柴胡、白芍、合欢花、合欢皮、僵蚕、蝉蜕、灯心草等8味药材组方，用于治疗肝郁伤神所致失眠症［1］。根据2020年版《中国药典（四部）》规定的僵蚕、酸枣仁等25个中药品种的黄曲霉毒素（AF）检查项和“中药中真菌毒素测定指导原则”［2］，应多加关注处方中含有易污染药材中成药品种的AF污染问题，目前，尚无有关舒眠胶囊（片）中AF的研究。AF属真菌毒素曲霉属，是黄曲霉和寄生曲霉产生的双呋喃环类剧毒次级代谢产物［3-4］，以AFB1，AFB2，AFG1，AFG2较常见［5-6］。中药材和饮片在生产工艺和储存运输过程中，易受基质、湿度、温度等因素影响，有可能发生霉变而产生AF污染，继而对人体健康产生危害。本研究中建立了同时测定舒眠胶囊（片）中AFB1，AFB2，AFG1，AFG2含量的超高效液相色谱串联三重四极杆质谱（UPLC-QQQ/MS）法，并对3家生产企业的舒眠胶囊和舒眠片样品进行检测，为评价制剂安全性提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent G7120A-G6460C型超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪，包括G7120A型二元梯度泵，G7167B型自动进样器，G7116B型柱温箱，MassHunter Workstation数据处理系统（安捷伦科技有限公司）；MS105DU/A型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为0.01 mg）；KQ-500DBG型数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）；TGL-20M型高速台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；PriboFast IAC型免疫亲和柱（青岛普瑞邦生物科技有限公司，规格为3 mL）。

1.2 试药

舒眠胶囊（贵州大隆有限责任公司，批号分别为20210511、20210906、20211028、20211115、20211224、20220109，规格为每粒0.4 g）；舒眠片（无锡济民可信山禾药业股份有限公司，批号分别为210923、211107、211212，北京长城制药厂，批号分别为20210607、20211123、20211218，规格均为每片0.48 g）；AF对照溶液（中国食品药品检定研究院，批号为610011-202104，AFB1，AFB2，AFG1，AFG2标示质量浓度分别为0.93，0.33，1.02，0.35 μg/mL）；乙腈、甲醇、乙酸铵均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 试验条件

色谱条件：色谱柱为AgilentZORBAXEclipsePlusC18柱（150 mm×2.1mm，2.6 μm）；流动相为9.0 mmol/L乙酸铵溶液（A）-甲醇-乙腈（1∶1，V/V，B），梯度洗脱（0～4.5 min时68%A→12%A，4.5～6 min时12%A→1%A，6～6.5 min，1%A→68%A，6.5～10 min时68%A）［7-8］；流速为0.3 mL/min；柱温为28℃；进样量为2 μL。

质谱条件［9-10］：电离方式为电喷雾离子源（ESI+）；检测方式为多反应监测模式（MRM），分析参数见表1；雾化气流速为7.5 L/min，温度为400℃；毛细管电压为0.6 kV；离子源温度为200℃。

表1 黄曲霉毒素质谱参数Tab.1 Mass spectrum parameters of aflatoxin

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：精密吸取AF对照溶液2 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液（AFB1，AFB2，AFG1，AFG2质量浓度分别为18.6，

6.6，20.4，7.0 ng/mL）。

供试品溶液：取样品或样品内容物适量，研细，取约3 g，精密称定，置均质瓶中，加入氯化钠5 g、正己烷100 mL［11］，30 000 r/min搅拌3 min，滤过，滤渣挥干，精密加入85%甲醇50 mL，5 000 r/min离心5 min，精密量取上清液20 mL，置50 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液10 mL，过免疫亲和柱（25℃），流速为3 mL/min，加水10 mL洗脱，弃去洗脱液，使空气入柱，挤出水，再加甲醇洗脱，收集洗脱液，置2 mL容量瓶中，并加甲醇定容，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

加标供试品溶液：取预试验中未检出AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，且与制备供试品溶液所用同一批样品，及系列混合对照品溶液适量，按供试品溶液制备方法制得加标供试品溶液。

空白对照溶液：不取样品，按供试品溶液制备方法制得空白对照溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液及空白对照溶液各适量，按2.1项下试验条件下进样测定，记录色谱图。结果空白对照无干扰，详见图1。

图1 总离子流图1.AFG2 2.AFG1 3.AFB2 4.AFB1A.Mixed reference solution B.Test solution C.Spiked test solution D.Blank reference solutionFig.1 Total ion chromatograms

线性关系考察：取2.2项下混合对照品溶液适量，加70%甲醇逐级稀释成AFB1，AFB2，AFG1，AFG2质量浓度分别为0.186，0.744，1.488，7.440，18.600 ng/mL；0.066，0.264，0.528，2.640，6.600 ng/mL；0.204，0.816，1.622，8.160，20.400 ng/mL；0.070，0.280，0.560，2.800，7.000 ng/mL的系列混合对照品溶液。按2.1项下试验条件进样测定，记录峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X，ng）为横坐标进行线性回归。结果见表2。

检测限与定量限考察：取混合对照品溶液适量，逐级稀释，以信噪比（S/N）为3∶1和10∶1时各待测成分的质量浓度为检测限和定量限。结果见表2。

表2 线性关系、检测限、定量限考察结果Tab.2 Results of linear relation test，limit of detection and limit of quantification

精密度试验：精密吸取混合对照品溶液2 μL，按2.1项下试验条件连续进样测定6次，记录离子强度。结果AFB1，AFB2，AFG1，AFG2峰面积的RSD分别为0.95%、1.33%、1.26%、1.34%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取2.2项下加标供试品溶液适量，分别于室温下放置0，3，6，9，12，15，18 h时按2.1项下试验条件进样测定，记录离子强度。结果AFB1，AFB2，AFG1，AFG2峰 面 积 的RSD分 别 为1.47%，1.92%，1.65%，1.78%（n=7），表明加标供试品溶液室温下放着18 h内基本稳定。

重复性试验：取样品或样品内容物适量，按2.2项下方法制备加标供试品溶液，共6份，按2.1项下试验条件进样测定，记录离子强度并计算含量。结果AFB1，AFB2，AFG1，AFG2含量的平均值分别为0.990 6，0.332 8，0.972 4，0.335 4 ng，RSD分别为1.85%，1.93%，2.06%，2.11%（n=6），表明方法重复性良好。

回收试验：取未检出AF的样品（批号为20211115，211107）约1.5 g，共9份，分别精密加入低、中、高质量浓度的混合对照品溶液各1.0 mL，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下试验条件进样测定，记录离子强度并计算回收率。结果见表3。

表3 舒眠胶囊回收试验结果（n=9）Tab.3 Results of the recovery test（n=9）

2.4 样品含量测定

取样品或样品内容物适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下试验条件下进样测定，记录离子强度。结果12批样品中均未检出AF。

3 讨论

目前测定中药中AF的方法主要有高效液相色谱-柱后光化学衍生法、高效液相色谱-柱后碘衍生荧光检测法、酶联免疫层析法及液相色谱质谱联用法等［8，12-14］。舒眠胶囊（片）成分复杂，基质干扰大，液相色谱质谱联用的MRM具有较高的灵敏度和专属性，可减少其衍生误差，排除基质干扰，避免假阳性结果。本研究中采用的UPLC-QQQ/MS法检测AF分析周期仅10 min，显著缩短了分析时间，减少了溶剂消耗，相比于高效液相色谱（HPLC）法具有更高的分析效率和更佳的峰容量。

预试验中对4种AF的母离子进行全扫描，结果发现4种AF在正离子模式下的响应值较高，然后通过仪器自动优化最佳的毛细管电压和碰撞能量，选取响应值高且稳定的2个子离子作为定性和定量离子；并依次考察了流动相系统（甲醇-乙酸铵、乙腈-乙酸铵、甲醇-甲酸、甲醇-乙腈-乙酸铵），柱温（25℃、28℃、30℃），进样量（1 μL、2 μL、5 μL），不同体积分数的甲醇提取溶剂（75%、85%、90%），过免疫亲和柱的流速（1mL/min、3mL/min、5 mL/min），过免疫亲和柱的温度（10℃、25℃、30℃、35℃），最终确定了正式试验条件及供试品溶液提取方法；同时发现柱温对测定结果影响不大，供试品溶液制备过程中免疫亲和柱上酶的活性与室内温度有关，免疫亲和柱中抗体与样品中抗原反应的时间也会影响结果的准确性。

依据2020年版《中国药典》对需进行AF检测的品种规定限量，AFG1，AFG2，AFB1，AFB2总量的最大限量不得超过5 μg/kg及10 μg/kg，本研究中12批样品中均检测出上述4种成分，符合药典规定。分析原因可能是与药品制备方法相关，舒眠胶囊（片）处方中是以僵蚕、蝉蜕及酸枣仁提取物入药，及企业对中成药生产工艺及中成药存放条件控制较严。

综上所述，本研究中建立了同时测定舒眠胶囊（片）中AFB1，AFB2，AFG1，AFG2的UPLC-QQQ/MS法，该法检测速度快且满足方法学验证各项指标，可作为检查该制剂中AF的依据，同时可为检查含僵蚕、蝉蜕及酸枣仁的中成药中的AF提供一定参考。试验结果显示，制剂在AF方面相对较安全，但若在其质量标准中增加AF检查项，还需进一步研究制剂中AF的限度。