脉动真空灭菌器灭菌效果验证

牛振东，路银环，刘文杰，陈 卓，井良义

（北京市药品检验研究院·中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京 102206）

国家食品药品监督管理局药品安全监管司/药品认证管理中心《药品生产验证指南》要求，药品生产过程中使用的灭菌设备安装、调试结束后，在正式投入使用前和使用一定时间后必须确认性能，可进行期间核查，应采用经过验证的灭菌工艺、操作规程和检测方法进行操作。高压灭菌器应经过生物指示剂挑战试验和B-D试验测试灭菌效果，合格后方可使用。生物指示剂挑战试验是验证灭菌器灭菌效果的重要手段，2020年版《中国药典（四部）》中将生物指示剂（BI）定义为一种对特定灭菌程序有确定及稳定耐受性的特殊活微生物制成品［1］。脉动真空灭菌器采用湿热灭菌法灭菌，即利用饱和蒸汽使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性从而杀灭微生物。蒸汽穿透力强，灭菌效果可靠，使用方便，广泛应用于病原微生物实验室，尤其是对器械、培养基、感染性废弃物等的消毒灭菌［2］。灭菌程序的建立、确定、验证和日常监控中，实验室需合理选择和使用BI，全面了解灭菌产品，确保灭菌参数能达到所需无菌保障水平。BI的耐受性及标准化应用等问题是决定灭菌工艺验证效果是否合理的关键，而合理有效的灭菌工艺直接关系医药产品的安全［3］。本研究中通过生物指标剂挑战试验及B-D试验分析脉动真定灭菌器的灭菌效果。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

仪器：1300 Series A2型生物安全柜（美国Thermo Fisher公司）；BIOBASE型生化培养箱（山东博科科学仪器有限公司）；BIST-A-D型电热脉动真空灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司，含1号锅和2号锅，其装载车分上下两层）。

试剂：压力蒸汽灭菌生物指示剂，包括嗜热脂肪地芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilusATCC 7953［芽孢数为（1～5）×106cfu/片，D值为1.3～1.9 min］，以及培养基（上海福泽医药器材有限公司，批号为210720）；B-D试验包（山东新华医疗器械股份有限公司，批号为21H02）。

1.2 方法

生物指示剂挑战试验：该试验能直接反映灭菌器在灭菌过程中的灭菌能力和效果，是灭菌器灭菌过程中最重要的监测手段［4］。试验分为试验组、阳性对照组、阴性对照组。脉动真空灭菌器装载车分为上下两层（1，2号锅），分别对上下两侧布点进行生物指示剂测试，每层布置9个监测点，分别进行空载和满载测试。试验组BI经121.0℃灭菌15 min，置换6 min后释放芽孢杆菌，于56℃培养48 h；阳性对照组芽孢杆菌于56℃培养48 h；阴性对照组仅有培养基，于56℃培养48 h。布点见表1，装载方式见图1。

图1 灭菌锅不同装载方式试验结果A1，B1.No.1 pot A2，B2.No.2 potA.No-load B.Full-loadFig.1 Test results of different loading modes of sterilizer pots

表1 生物指示剂挑战试验结果Tab.1 Results of the biological indicator challenge test

B-D测试法：将试验包置灭菌器室内排气口处关闭柜门［5］，134℃灭菌3.5 min，脉动3次，完毕，取出测试图，观察测试结果（试验试纸由黄色转为黑色，表明灭菌有效）。实验室应根据灭菌器使用的年限和频率等因素制订相应的B-D监测规范。

指示胶带的使用：应在每次灭菌过程中使用，主要用于区分是否进行过灭菌处理。但不能据此结果判定灭菌是否合格［6］，只有结合其他手段综合评估才能判断灭菌效果。

2 结果

生物指示剂挑战试验结果见表1（试验组及阴性对照组灭菌前后均呈紫红色、澄清状）和图1。B-D测试结果显示，试验试纸由黄色转为黑色。

3 讨论

2020年初新型冠状病毒肺炎疫情（简称新冠疫情）的暴发，加深了人们对生物安全的认识，实验室生物安全也愈加凸显。我国出台《生物安全法》并于2021年4月15日起实施，该法细致详细，为生物安全领域首次立法，凸显国家对生物安全的重视。对此，病原微生物实验室应建立质量与生物安全管理体系、人员管理、菌（毒）种和阳性样本的管理、环境与设备管理、废弃物安全、个人防护和应急预案等。加强灭菌器性能验证及其规范操作对微生物实验室至关重要。

第40版《美国药典》及第8版《欧洲药典》均指出，BI是一种对特定灭菌程序有确定及稳定耐受性的特殊活微生物制成品，其常用于确认灭菌设备性能，及特定物品的灭菌工艺研发、建立和验证等。BI主要分菌片式和自含式，菌片式BI需要未灭菌的菌片和无菌培养基，本试验中所用的为自含式BI，本身含有菌种和培养基，可有效避免外界杂菌的污染。Bowie等发明的验证预真空灭菌器的真空系统是否功能正常的方法即B-D测试法［7］，适用于预真空压力蒸汽灭菌器空气排除效果的检测，及日常灭菌中空气排除效果监测、设计灭菌操作规程时的核查、灭菌器研制中及维修后性能的测定、新灭菌器安装调试后效果的测定等。医用消毒灭菌指示胶带是灭菌过程指示产品，通过胶带上的指示油墨在经消毒灭菌作用后颜色发生变化，从而判定物品是否经消毒处理，直观简洁地反映物品灭菌状态。

随着生物安全要求越来越受到重视，有效的灭菌效果监测和灭菌器工艺开发显得尤为重要，和欧美国家相比，我国灭菌工艺相关的法规、标准、规范和指导原则相对不健全。近年来，国家药品改革不断深入，对于药品无菌工艺保障要求越来越多，无菌工艺也是药品安全性保障的重要指标，对相应指导原则或标准规范的需求就更迫切，为此，2020年版《中国药典（四部）》通则在以往版本的基础上对灭菌法进行了重大修订，增加了与灭菌工艺相关的2个BI的指导原则，即通则9207（灭菌用生物指示剂指导原则）和通则9208（生物指示剂耐受性检查法指导原则）。2020年12月31日，国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）正式发布《化学药品注射剂灭菌和无菌工艺研究及验证指导原则（试行）》并试行。上述指导原则的发布，为BI的质量控制提供了参考，为检测实验室和药品生产企业在灭菌工艺研究、灭菌效果验证和日常灭菌监控中正确选用BI提供了技术指导，同时，良好的灭菌工艺能减少药品污染，降低实验室感染性材料灭菌不彻底的风险。

综上所述，本研究中确立了适用于本实验室的脉动真空灭菌器的灭菌程序、装载方式及其日常监测的方法。初步确定的灭菌程序（121℃灭菌15 min），能杀灭孢子菌而达到预期灭菌效果，保障培养基和试剂的灭菌质量。在日常微生物检验过程中，用该灭菌程序能彻底杀灭包括孢子菌在内的所有微生物，而不会因为杀菌不彻底，检验用物品引入微生物造成假阳性风险。蒸汽灭菌器可满足日常检验时的灭菌使用要求。需注意在每次灭菌时应使用指示胶带，根据灭菌器的使用年限和使用频率定期进行B-D试验和生物指示剂挑战试验。