野生灵芝分离鉴定、生物学特性及活性成分分析

雷 萍，张文隽，郝 哲，马婧嘉，梁海燕，李雅茹，吴亚召

(1.陕西省微生物研究所，西安 710043；2.榆林市农垦服务中心，陕西榆林 719000)

灵芝(Ganodermalucidum)隶属担子菌门(Basidiomycota)伞菌纲(Agaricomycetes)多孔菌目(Polyporales)灵芝科(Ganodermataceae)灵芝属(Ganoderma)，别称赤芝、红芝、木灵芝、万年蕈、灵芝草等[1]，是一类珍贵的药用大型真菌。在中国已有2000多年的记载和应用历史[2]，据《神农本草经》记载：灵芝主治胸中结、益心气、增智慧、不忘、延年[3]。现代研究表明灵芝含有多糖、三萜类、甾醇类、黄酮类、酚类、氨基酸类、糖苷类等活性成分[4-5]，其具有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、保肝护肝、降血糖血脂、治疗慢性肾病等显著的药理功效[6-13]，已被开发成多种药品和保健品，成为现代医学研究的热点。

目前，中国已发现灵芝科4个属种质资源103种，占世界已知灵芝科种类的88%[14]。但现阶段中国人工栽培的灵芝菌株基本引自韩国和日本等地，存在菌种活性退化、产量低、品质差、抗杂抗病能力不强等问题，适宜中国各产地栽培、具有自主知识产权的优良品种缺乏[15]。同时野生灵芝形态特征常受外部环境影响而发生变化，不同灵芝科的不同种经常共有许多鉴别性特征，仅利用传统的形态学鉴定较为困难，有必要利用分子生物学技术鉴定其种属。本研究对采自陕西省安康市平利县山区的一株野生灵芝进行ITS序列分析鉴定，并系统研究其适合生长的培养条件，分析比较人工栽培子实体主要活性成分，以期为野生灵芝种质资源的科学开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株 2020-06-28于陕西省安康市平利县山区一棵枯树桩基部采集野生灵芝子实体，组织分离获得纯菌丝，编号为灵芝-LG；对照菌株灵芝SW01和泰山灵芝为陕西省微生物研究所微生物技术研究中心保藏菌种。

1.1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯(去皮、浸汁)200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然；基础培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.5 g，维生素B110 mg，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然；栽培培养基：木屑44%，棉籽壳44%，麸皮5%，玉米粉5%，蔗糖1%，石膏1%，料水比1∶1.2。

1.2 基于ITS序列分析的生物学鉴定

1.2.1 基因组DNA提取 取0.5 g菌丝体置于研钵，加入液氮充分研磨，将样品粉末移入盛有CTAB的小管55～65 ℃孵育1 h，放置室温后加入等体积氯仿/异戊醇抽提，12 000 r/min、室温离心10 min取上清液，加入1倍体积NaAC和异丙醇沉淀DNA，12 000 r/min、4 ℃离心20 min弃上清液，70%乙醇洗涤沉淀2次，干燥后加入TE缓冲液溶解，以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。

1.2.2 ITS序列扩增及检测 采用通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)进行rDNA ITS区段的PCR扩增[16]。扩增条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性60 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30个循环；72 ℃反应10 min，10 ℃终止。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳检测。

1.2.3 rDNA ITS序列克隆与测序 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，以PCR纯化试剂盒回收后连接入pEASY○R-T1载体，使用TOP10转化连接产物，培养1 h后涂平板培养，随机挑选阳性克隆送至北京天一辉远生物公司进行序列 测定。

1.2.4 分子鉴定与系统发育分析 对所得ITS序列进行校正，在GenBank核酸序列数据库中进行同源性比较搜索(BLASTn)。根据搜索结果下载与之相关的序列，以ClustalX(1.83)进行序列比对，采用MEGA 7.0进行系统学分析，构建系统发育树。

1.3 生物学特性试验

1.3.1 碳源选择试验 按照基础培养基，分别以葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、D-麦芽糖、可溶性淀粉、玉米粉各20 g/L作为碳源，以不加碳源作为对照。采用直径80 mm的培养皿，每个培养皿分别加入20 mL培养基，制备好平板培养基后于中央接种一块直径0.5 cm的菌种块，26 ℃恒温培养，每个处理6次重复，观察记录菌丝生长情况。

1.3.2 氮源选择试验 按照基础培养基，分别以蛋白胨、酵母膏、硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵、尿素、麸皮各5 g/L作为氮源，以不加氮源作为对照。方法同上。

1.3.3 无机盐选择试验 按照基础培养基，分别以磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸钠各1 g/L作为无机盐，以不加无机盐作为对照。方法同上。

1.3.4 初始pH选择试验 配制PDA培养基，以浓度1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节初始pH分别为：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0。方法同上。

1.3.5 温度选择试验 以PDA培养基制备平板，采用直径80 mm的培养皿，每个培养皿分别加入20 mL培养基，制备好平板培养基后于中央接种一块直径0.5 cm的菌种块，分别于18 ℃、 20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃和 34 ℃条件下恒温培养，每个处理6次重复，观察记录菌丝生长情况。

1.3.6 正交优化试验 在单因素筛选的基础上，选择最佳碳源(葡萄糖∶蔗糖=1∶1)、氮源、无机盐及初始pH进行四因素三水平正交试验，试验因素及其各水平见表1。

1.3.7 测定方法 待菌丝萌发2 d后，采用十字交叉法测量菌落直径，继续培养5 d再测量一次并计算菌丝生长速度。计算公式如下：

菌丝生长速度(mm/d)=菌落半径增长度(mm)/菌丝生长时间(d)

1.4 活性成分分析

1.4.1 样品制备 按照栽培培养基制备栽培袋，分别接入待测菌种和对照菌种，菌丝满袋成熟后常规管理方法出芝，待子实体成熟采收。于65 ℃鼓风干燥箱中烘干至恒质量，粉碎，过孔径为 0.25 mm(60目)筛网，收集粉末密封保存，备用。

表1 L9(34)正交试验的因素及水平Table 1 Factors and its levels in L9(34) orthogonal test

1.4.2 多糖含量测定 准确称取样品0.5 g于250 mL具塞锥形瓶中，加入15 mL蒸馏水，95 ℃水浴提取2 h，过滤，滤液置50 mL容量瓶，滤渣重复提取1次，过滤，合并两次滤液于同一容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得水提液。吸取5 mL水提液加入95%乙醇20 mL，4 ℃醇沉24 h，离心，沉淀用蒸馏水定容至10 mL，摇匀，即得供试品溶液。以葡萄糖为标准品，采用蒽酮-硫酸法测定多糖含量[17]。

1.4.3 三萜含量测定 参考《中国药典》2020年版灵芝三萜含量测定方法[18]。准确称取样品2.0 g于250 mL具塞锥形瓶中，加入90%乙醇50 mL，超声处理(功率140 W，频率42 kHz)45 min，过滤，滤液置100 mL容量瓶，90%乙醇分次洗涤滤器和滤渣，洗液并入同一容量瓶中，加入90%乙醇定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。以齐墩果酸为标准品，采用香草醛-冰醋酸法测定三萜含量。

1.4.4 蛋白质含量测定 准确称取样品0.25 g放入凯氏定氮瓶中，同时加入6 g硫酸钾和0.4 g硫酸铜，然后加入10 mL浓硫酸，充分摇匀。采用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量[19]。

1.5 数据分析

采用ClustalX(1.83)和MEGA 7.0软件，对待测菌株和与之相关的ITS序列进行系统发育分析；采用SPSS 17.0数据处理系统，对相关试验数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 基于ITS序列的系统发育分析

通过ITS序列检测分析，确定灵芝-LG菌株的ITS片段序列长度为635 bp；通过GenBank数据库同源性比对，结果表明灵芝-LG与Ganodermalucidum(GenBank号EU021456.1)序列同源性为100%；下载与之相关的灵芝属菌株ITS序列，利用MEGA 7.0构建系统发育树，由图1可以看出，灵芝-LG与Ganodermalucidum以100%支持率聚在一起，系统发育树结果与同源性比对结果表现出较高的一致性，进一步说明系统进化树的可靠性。因此，可以确定该野生菌株灵芝-LG为赤芝[Ganodermalucidum(Curtis) P.Karst.]。

图1 基于rDNA ITS序列的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence

2.2 菌丝生物学特性

2.2.1 碳源对灵芝-LG菌丝生长的影响 试验考察不同碳源对灵芝-LG菌丝生长的影响，结果如表2所示，灵芝-LG菌丝在7种培养基上均能生长，且优于空白对照。其中以玉米粉为碳源时菌丝生长速度最快(7.69 mm/d)，但菌丝生长势较差，菌丝白色、较纤弱无力、较稀疏、边缘较整齐；当以葡萄糖、蔗糖为碳源时，菌丝生长速度次于前者，分别为5.59 mm/d和5.56 mm/d，两者之间差异不显著，且菌丝生长势均较好；以乳糖作为碳源时，菌丝生长速度最慢(2.95 mm/d)，菌丝生长势也较差，菌丝白色、较纤弱无力、较稀疏、边缘较整齐。因此，综合考察菌丝生长速度和生长势，灵芝-LG菌丝生长最适碳源为葡萄糖和蔗糖。

表2 碳源对灵芝-LG菌丝生长的影响Table 2 Effect of carbon source on mycelia growth of G.lucidum-LG

2.2.2 氮源对灵芝-LG菌丝生长的影响 试验考察不同氮源对灵芝-LG菌丝生长的影响，结果如表3所示，从表中可以看出灵芝-LG在7种培养基上均能生长，不添加任何氮源则菌丝几乎不生长，各组之间差异显著。其中，以酵母膏为氮源时菌丝生长速度最快(7.30 mm/d)，菌丝生长势好，洁白、粗壮有力、浓密、边缘整齐；以麸皮为氮源时菌丝生长速度次之(7.01>mm/d)，但菌丝生长势差，菌丝白色、纤弱无力、稀疏、边缘较整齐；以硝酸铵为氮源时菌丝生长速度最差(2.91 mm/d)，菌丝白色、较纤弱无力、较稀疏、边缘不整齐。因此，综合考察菌丝生长速度和生长势，灵芝-LG菌丝生长最适氮源为酵母膏。

表3 氮源对灵芝-LG菌丝生长的影响Table 3 Effect of nitrogen source on mycelia growth of G.lucidum-LG

2.2.3 无机盐对灵芝-LG菌丝生长的影响 考察不同无机盐对灵芝-LG菌丝生长的影响，结果如表4所示，从表中可以看出灵芝-LG在6种无机盐培养基上均能生长，且不添加任何无机盐时菌丝仍然可以正常生长，各组之间差异显著。其中，以磷酸二氢钾为无机盐时菌丝生长速度最快(5.43 mm/d)，菌丝生长势好，洁白、粗壮有力、浓密、边缘整齐；以硫酸镁为无机盐时菌丝生长速度次之(5.04 mm/d)，菌丝生长势也好；以氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸钠为无机盐时，菌丝生长速度均较不添加任何无机盐时还差，其中以氯化钾效果最差，菌丝生长速度2.74 mm/d，菌丝生长势也较差，菌丝洁白、较纤弱无力、较稀疏、边缘较整齐。因此，综合考察菌丝生长速度和生长势，灵芝-LG菌丝生长最适无机盐为磷酸二氢钾。

表4 无机盐对灵芝-LG菌丝生长的影响Table 4 Effect of inorganic salts on mycelia growth of G.lucidum-LG

2.2.4 初始pH对灵芝-LG菌丝生长的影响 考察培养基不同初始pH对灵芝-LG菌丝生长的影响，结果如表5所示。灵芝-LG在初始pH 5.0～9.0之间均能生长，其中初始pH为7.0时菌丝生长速度最快(6.32 mm/d)，菌丝生长势好，洁白、粗壮有力、浓密、边缘整齐；初始pH为7.5时菌丝生长速度次之 (6.01 mm/d)，菌丝生长势较好，洁白、较粗壮有力、较浓密、边缘较整齐；当初始pH为5.5和5.0时，菌丝生长速度均最差，两者之间差异不显著，但初始pH 5.0的菌丝生长势更差，菌丝洁白、较纤弱无力、较稀疏、边缘较整齐。因此，综合考察菌丝生长速度和生长势，灵芝-LG菌丝生长最适初始pH为7.0。

表5 初始pH对灵芝-LG菌丝生长的影响Table 5 Effect of initial pH on mycelia growth of G.lucidum-LG

2.2.5 温度对灵芝-LG菌丝生长的影响 考察不同培养温度对灵芝-LG菌丝生长的影响，结果如表6所示。灵芝-LG菌丝在温度18～34 ℃之间均能生长，其中26 ℃、 28 ℃条件下菌丝生长速度均最快，两者之间无显著差异，分别为5.23 mm/d和5.17 mm/d，菌丝生长势均较佳；培养温度为30 ℃时菌丝生长速度次之(3.12 mm/d)，但菌丝生长势较弱，24 ℃菌丝生长速度较前者稍慢(2.75 mm/d)，但菌丝生长势较好；18 ℃时菌丝生长速度与生长势均最差。因此，综合考察菌丝生长速度和生长势，灵芝-LG菌丝生长适宜温度为26～28 ℃。

2.2.6 正交试验优化结果与直观分析 根据单因素筛选试验结果，选取最佳碳源、氮源、无机盐及初始pH进行四因素三水平正交试验，结果见表7。由表中可以看出，4个因素碳源、氮源、无机盐和初始pH的极差R分别为2.19、1.23、0.89和0.92，所以影响灵芝-LG菌丝生长的因素依次为A(碳源)>B(氮源)>D(初始pH)>C(无机盐)；其中，碳源均值由大至小依次为X3>X2>X1，氮源为X2>X1>X3，无机盐为X2>X1>X3，初始pH为X1>X3>X2，可以得出最佳因子组合为A3B2C2D1，即灵芝-LG的最佳培养条件为葡萄糖15 g/L、蔗糖15 g/L、酵母膏5 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、初始pH 6.5。

表6 温度对灵芝-LG菌丝生长的影响Table 6 Effect of temperature on mycelia growth of G.lucidum-LG

2.3 主要活性成分

考察试验菌株灵芝-LG与对照菌株灵芝SW01、泰山灵芝人工栽培子实体主要活性成分含量，结果见表8。同等培养条件下，灵芝-LG的多糖含量最高(1.42%)，泰山灵芝次之，灵芝SW01最差，三者之间差异显著；灵芝-LG的三萜含量也最高(3.05%)，灵芝SW01和泰山灵芝次之，前者与后两者之间差异显著，后两者之间无显著差异；灵芝-LG的蛋白质含量为17.74%，稍低于对照菌株灵芝SW01(18.43%)，泰山灵芝最差，三者之间差异显著。综合考察3种主要活性成分多糖、三萜和蛋白质的总含量，灵芝-LG明显高于2个对照菌株灵芝SW01和泰山灵芝，为一株活性成分含量较高的栽培品种。

表7 L9(34)正交试验结果直观分析表Table 7 Intuitive analysis table for result of L9(34) orthogonal test

表8 不同灵芝活性成分含量比较Table 8 Comparison of active components of different kinds of G.lucidum

3 讨 论

灵芝是一类具有重要经济价值的药用真菌，在我国应用历史悠久，目前文献记载可栽培或有利用价值的灵芝属种类大约有17种。灵芝属传统分类方法以子实体的外部特征、形态结构解剖及担孢子的特征为主，易受环境因素影响，无法客观的区别各菌株间的类源关系，分子生物学鉴定手段具有客观性、稳定性、准确性，是传统分类手段的重要补充[20]。本研究采用ITS序列分析技术对灵芝-LG菌株的ITS序列进行同源性比对和系统发育树构建，确定采集自陕西省安康市平利县山区的野生菌株灵芝-LG为赤芝[Ganodermalucidum(Curtis) P.Karst.]，明确了该野生菌株的分类学地位。

菌丝生长速度和长势是优质菌株选择的重要指标之一[21]。本研究通过单因素试验，确定了野生菌株灵芝-LG菌丝生长最适碳源为葡萄糖和蔗糖，最适氮源为酵母膏，最适无机盐为磷酸二氢钾，最适初始pH为7.0，适宜培养温度为26～ 28 ℃；进一步正交优化得到最佳培养条件：葡萄糖15 g/L，蔗糖15 g/L，酵母膏5 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，初始pH 6.5。与其他研究结果对比发现不同种类的灵芝培养条件有一定差异，马博等[22]报道有柄灵芝最适碳源为果糖或葡萄糖，氮源为酵母提取物，温度为30 ℃，pH 5.5；陈旭等[23]报道鹿角灵芝优质碳氮源分别为可溶性淀粉、蛋白胨，最佳培养条件为初始pH 6.0和 30 ℃；兰玉菲等[24]报道灵芝、树舌灵芝和紫芝的最适碳源分别为蔗糖、葡萄糖和麦芽糖，最适氮源均为酵母膏，灵芝菌丝最适培养温度为25 ℃，树舌灵芝和紫芝为25～30 ℃。不同灵芝菌株菌丝培养条件之所以存在差异，可能和菌株所在生境长期驯化有关。因此，只有研究明确野生菌株的生物学特性，才有利于进一步研究应用。

中国野生灵芝种质资源丰富，但由于其不合理的开发利用，近年来成功商业栽培的灵芝种类有限，部分菌种出现菌种退化现象，有必要选择性能优良的野生菌株进行进一步驯化栽培，开发活性物质高的栽培品种[25]。本研究中同等培养条件下，灵芝-LG人工栽培子实体多糖、三萜含量分别为1.42%和3.05%，明显高于对照菌株；蛋白质含量为17.74%，虽稍低于对照菌株灵芝SW01，但3种主要活性成分多糖、三萜和蛋白质的总含量明显高于2株对照菌株灵芝SW01和泰山灵芝。综上所述，野生菌株灵芝-LG为一株活性成分含量较高的栽培品种，可进一步系统研究其栽培特性和药理功效，以期通过科学的栽培管理更好的提高活性成分含量，并充分开发利用其药用价值。