分光光度法与液相色谱-质谱联用法测定特殊医学用途婴儿配方奶粉中左旋肉碱比较

陈伟杰，叶 妍

（1.华南农业大学，广东广州 510642；2.深圳计量质量检测研究院，广东深圳 518131）

左旋肉碱（L-carnitine），也称肉毒素或维生素BT，其作为跨线粒体膜酰基载体促进脂肪酸的β氧化，并通过血脑屏障改善大脑的认知功能[1]。婴幼儿机体尚未发育成熟，无法足量合成左旋肉碱，因此L-肉碱是婴幼儿必需的营养素。目前，检测L-肉碱的方法主要有分光光度法[2]、离子色谱法[3]、高效液相色谱法[4]和液相色谱-质谱联用法[5]。《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定》（GB 29989—2013）为分光光度法，该法原理为样品中左旋肉碱经蛋白沉淀、皂化等一系列反应后生成黄色物质，通过其颜色深度间接计算L-肉碱含量。日常检测中发现，国标法测定特殊医学用途配方奶粉时，高氯酸沉淀蛋白质后难以过滤，结果重复性差，准确度低。此现象由此类样品中氨基酸多肽小分子或麦芽糊精的物理性质导致，研究发现，适量Taka淀粉酶酶解，可解决上述问题[6]。液相色谱-质谱联用法具有操作简单、准确度好、灵敏度高的优势，已有研究使用液相色谱-质谱联用法测定婴幼儿奶粉中左旋肉碱，且取得了良好的效果。

实验以特殊医学用途配方奶粉为例，分别采用《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定》（GB 29989—2013）分光光度法、淀粉酶酶解优化的分光光度法、液相色谱-质谱联用法进行检验，对3种方法测定结果的精密度、回收率、显著性差异进行分析，为特殊医学用途婴儿配方奶粉中左旋肉碱实验室方法应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器设备与试剂

材料：市售氨基酸配方奶粉、乳蛋白水解婴儿配方奶粉。仪器设备：电子天平、数字式酸度计PB-10、涡旋振荡器、离心机、振荡水浴槽、超声提取仪、紫外分光光度计及液相色谱-串联质谱联用仪TSQ Quantis。标准品：左旋肉碱标准品（CAS号：541-15-1）、左旋肉碱-D3标准品（CAS号：350818-62-1）。试剂：盐酸、甲酸（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、2-硝基苯甲酸、高氯酸、氢氧化钠、氢氧化钾、乙二胺四乙酸二钠、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸（C8H18N2O4S)、TaKa淀粉酶、乙酰辅酶A（AcetylCoA）和乙酰肉碱转移酶A（CAT）。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂配制

（1）肉碱标准储备溶液（86.4 mg·L-1）。称量 20 mg（精确0.000 1 g）L-肉碱于250 mL容量瓶中，用纯水定容至刻度。

（2）肉碱标准中间液（1.08 mg·L-1）。准确移取标准储备溶液1.25 mL于100 mL容量瓶中，用纯水定容至刻度。

（3）左旋肉碱 -D3标准储备液（10.0 mg·mL-1）。准确称取100 mg（精确0.000 1 g）D3-左旋肉碱于10 mL容量瓶，用纯水定容至刻度。

（4）左旋肉碱标准工作液。①分光光度法。分别吸取系列体积L-肉碱标准储备液（86.4 mg·L-1）于25 mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，该系列标准溶液的质量浓度分别为 0.864 µg·mL-1、1.730 µg·mL-1、3.460 µg·mL-1、6.910 µg·mL-1、10.400 µg·mL-1和 17.300 µg·mL-1，临用时配制。②液相色谱-质谱联用法。分别吸取系列体积L-肉碱标准中间液（1.08 mg·L-1）于10 mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，该系列标准溶液质量浓度分别为 4.32 µg·L-1、8.64 µg·L-1、21.6 µg·L-1、43.2 µg·L-1、64.8 µg·L-1和 86.4 µg·L-1，临用时配制。

（5）乙酰辅酶A溶液。于离心管中加入20.0 mg乙酰辅酶A，并加入2.0 mL纯水使其溶解，临用时配制。

（6）乙酰肉碱转移酶溶液。于离心管中加入100 µL乙酰肉碱转移酶，9 500 r·min-1离心5 min，弃去上层清液，残渣用2.0 mL纯水充分溶解，临用时配制。

（7）显色液的配制。①显色原液。于烧杯中依次放入2-硝基苯甲酸0.050 g、N-2-羟乙基哌嗪-2-乙烷磺酸5.96 g及乙二胺四乙酸二钠0.185 g后，加入30 mL纯水溶解，再用10 mol·L-1NaOH溶液调节pH值至7.5±1.0，转移至50 mL容量瓶，纯水定容至刻度。可冷藏保存3个月。②显色工作液。使用纯水将显色原液稀释5倍。

（8）TaKa淀粉酶溶液。于烧杯中放入2.50 g TaKa淀粉酶，加入50 mL纯水，使其充分溶解，临用时配制。

1.2.2 分光光度法分析步骤

（1）试样处理。①分光光度法。称5 g试样于烧杯中，取适量（35±5）℃的纯水使其溶解，转入100 mL容量瓶后，加入13%高氯酸溶液10 mL，摇匀并静置20 min，用纯水定容至刻度后混匀过滤。取20 mL滤液，用4 mol·L-1氢氧化钾溶液调节pH值至12.75±0.25，40 ℃水浴1 h，冷却后用13%高氯酸调节pH值至7.25±0.25。将处理溶液转入50 mL容量瓶中，并用纯水定容至刻度，于4 ℃冰箱冷藏16 h。取出样品处理溶液待其常温，上清液用0.45 µm滤膜过滤备用。②淀粉酶解优化的分光光度法。称5 g试样于烧杯中，适量温水溶解后转入100 mL容量瓶中。加入Taka淀粉酶溶液1 mL并混匀，60 ℃水浴0.5 h，后续操作与GB 29989—2013分光光度法一致。

（2）标准曲线绘制。将仪器波长调为412 nm，在比色皿中依次加入标准工作液2 mL，800 µL显色工作液和100 µL乙酰辅酶A溶液，使用移液枪小心抽提数次，5 min后归零。迅速加入100 µL乙酰肉碱转移酶溶液，使用移液枪小心抽提数次，10 min后测定吸光值。以肉碱标准系列浓度为横坐标，吸光值作纵坐标绘制标准曲线。GB 29989—2013与淀粉酶酶解优化的分光光度法同时测定，两种方法仅在试样前处理过程有差异，故两种方法共用此标准曲线。

1.2.3 液相色谱-质谱联用法分析步骤

（1）色谱分析条件。色谱柱Hypersil GOLDTMPEI HILIC LC（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸水。流速：0.3 mL·min-1。柱温：35 ℃。进样量：10 μL。梯度洗脱程序：0～1 min（A：20%→95%，B：80%→5%）；1.0～ 4.5 min（A：95%→20%，B：5%→80%）；4.5～ 7.0 min（A：20%，B：80%）保持平衡。

（2）质谱分析条件。离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测；正离子喷雾电压：3 500 V；负离子喷雾电压：2 500 V；离子转化管温度：350 ℃；蒸发器温度：350 ℃；雾化气（N2）：45 psig；去溶剂气（N2）：45 psig。多反应监测参数：左旋肉碱，母离子162（m/z），子离子103/60（m/z），碰撞能量20.0/16.5（V）；左旋肉碱-D3，母离子165（m/z），子离子103/63（m/z），碰撞能量20.0/16.5（V）。

（3）试样处理。称2.5 g试样于25 mL比色管中，加入左旋肉碱-D3标准储备液200 µL，用10 mL温水涡旋溶解后，移取10 mL至100 mL比色管，加入0.5 mL盐酸后摇匀，于60 ℃超声水解1 h，取出置于常温，纯水定容并摇匀后过滤。取滤液0.050 mL至10 mL容量瓶中并用纯水定容，经0.45 µm滤膜过滤后备用。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

以肉碱标准系列浓度为横坐标（X），纵坐标（Y）为吸光值，绘制标准曲线。分光光度法线性范围为0～17 µg·mL-1，方程为y=0.051 6x+0.014 1，相关系数为0.999 5，检出限0.6 mg/100 g；液相色谱-串联质谱联用法线性范围0～90 ng·mL-1，方程为y=0.012 2x-0.009 4，相关系数为 0.999 7，检出限 0.1 µg·kg-1。

2.2 3种方法结果对比

2.2.1 精密度实验

由表1可知，国标法测定三类特殊医学用途配方奶粉中左旋肉碱，测定结果偏差较大。优化后的分光光度法测定结果整体上略低于液质联用法测定结果，原因可能为分光光度法基于酶反应与显色反应间接计算左旋肉碱含量，此过程的反应可能不完全。

表1 3种方法的左旋肉碱测定结果（n=6）

2.2.2 回收率实验

由表2可知，国家标准法测定特殊医学用途配方奶粉平均加标回收率为78.0%～82.5%，回收率较低；优化后的分光光度法平均加标回收率为93.6%～101.0%；液质联用法平均加标回收率为96.7%～101.0%。

表2 3种方法测得的左旋肉碱加标回收率（n=6）

2.2.3 酶解分光光度法与液质联用法的Levene方差齐性检验结果

分别使用酶解分光光度法与液质联用法对特殊医学用途配方奶粉左旋肉碱进行测定，并对结果进行差异性分析，结果见表3与表4。结果表明，对于氨基酸配方奶粉，优化后的分光光度法与液质联用法测定结果方差显著性=0.533＞0.05，均值显著性=0.079＞0.05；对于乳蛋白深度水解配方奶粉，优化分光光度法与液质联用法测定结果方差显著性=0.365＞0.05，均值显著性=0.270＞0.05；对于乳蛋白部分水解配方奶粉，优化分光光度法与液质联用法测定结果方差显著性=0.295＞0.05，均值显著性=0.272＞0.05。因此，可认为优化分光光度法与液质联用法测定特殊医学用途配方奶粉结果无显著差异。

表3 优化后酶解分光光度法与液质联用法测定左旋肉碱的数据对比

表4 优化后酶解分光光度法与液质联用法独立样本t检验结果

3 结论

对国标法、优化后的淀粉酶酶解分光光度法及液质联用法测定特殊医学用途配方奶粉左旋肉碱的精密度以及加标回收率进行比较分析，结果表明GB 29989—2013测定特殊医学用途配方奶粉，过滤困难，数据离散程度大，回收率低。优化后的分光光度法解决了以上3类特殊医学用途配方奶粉过滤困难的问题，且结果满足实验室质量控制要求。对优化后酶解分光光度法与液质联用法结果进行方差齐性检验，表明两种方法结果无显著差异。后续对特殊医学用途配方奶粉左旋肉碱测定时，可根据样品批次量，实验室设备条件等因素进行方法选择。