福建省猪源多黏菌素耐药基因mcr-1阳性细菌的耐药特性及分布特征

车勇良，陈秋勇，陈如敬，吴学敏，王隆柏，刘玉涛，周伦江

(福建省农业科学院 畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建福州 350013)

由于抗生素的滥用，细菌对抗生素的耐药性日趋严重，尤其是多重耐药细菌或“超级”细菌的产生，导致临床上无药可用，给全世界的公共卫生安全带来严峻挑战[1-2]。耐药性病原菌引起的感染性疾病的发生率和死亡率大大增加，给人类和动物的健康造成了巨大威胁[3]。多黏菌素是一种阳离子多肽，临床上主要包括多黏菌素B和多黏菌素E，其因对机体有一定的肾毒性，导致在临床上的使用受限，以前仅用于肠道感染严重的病例。然而近年来，多黏菌素作为治疗病原菌感染的最后一道防线，常用于治疗一些多重耐药、尤其是感染产碳青霉烯酶菌株的患者。多黏菌素的使用已有几十年的历史，但由于其未曾广泛用于临床，因此有关其耐药性问题仅有一些零星报道。近几年，由于多重耐药菌株的增多，多黏菌素的使用也随之增加，有关其耐药情况的报道亦随之增多[4-7]。据报道，细菌对多黏菌素耐药的主要机制是，细菌染色体编码的二元调控系统pmrAB和phoPQ的突变以及相关调控基因mgrB的失活导致细菌脂多糖上的脂质A被修饰，从而降低了细菌对多黏菌素的亲和力，引起耐药[8]。2015年底多黏菌素耐药基因mcr-1首次被发现[9]，该基因是由质粒介导、可以在不同细菌间水平传播的耐药基因。mcr-1耐药基因一经报道，就引起了世界公共卫生领域研究者的广泛关注，但对mcr-1基因阳性菌的耐药特性和分布特征却报道甚少。因此，掌握多黏菌素耐药菌的耐药特性和分布特征，对预防和控制此类耐药菌的感染有重要意义。本研究从福建省7地市的21家猪场采集粪便样品，应用PCR方法筛选、分离和鉴定mcr-1基因阳性细菌，采用K-B琼脂药敏试验和PCR方法分析其耐药性和耐药表型，用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)方法鉴定mcr-1基因阳性大肠杆菌的类型，并用脉冲场凝胶电泳分析(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)方法对这些大肠杆菌进行聚类分析，探明细菌间的亲缘关系，旨在为多黏菌素耐药菌的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 粪便样本和药敏试验质控菌 2017-2021年，从福建省南平、龙岩、三明、平潭、宁德、漳州和福州等7个地市的21个猪场，用专用粪便收集管采集猪粪便样本313份；药敏试验质控菌株为大肠杆菌ATCC25922，购自中国兽医药品监察所。

1.1.2 主要试剂 TSA、TSB培养基,购自OXOID公司；绵羊血,购自郑州九龙生物科技有限公司；PCR试剂、蛋白酶K,均购自Promega公司；限制性内切酶XbaⅠ，购自宝生物(大连)有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自北京天根科技有限公司；Gelred，购自美国Biotium公司。

1.1.3 药敏纸片 阿莫西林、链霉素、头孢噻肟、氟苯尼考、亚胺培南、林可-壮观、利奈唑胺、新霉素、多黏菌素B、磺胺甲基异恶唑、替加环素、万古霉素、强力霉素、恩诺沙星、呋喃妥因药敏纸片，均购自温州市康泰生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1mcr-1基因阳性细菌的分离与鉴定 将采集的新鲜猪粪便在24 h内低温运送至实验室，向每份粪便管中加入2 mL无菌TSB培养基，振荡器振摇2 min，用接种环挑取粪便液划线接种于体积分数10%绵羊血平板，倒置于37 ℃培养箱培养36～48 h。挑取培养后的混合菌于1.5 mL离心管(预置1 mL的无菌PBS缓冲液)，振荡器振摇混匀2 min，加热煮沸5 min，12 000 r/min离心5 min，吸出上清液于新的离心管中，-20 ℃保存备用。以获得的上清液为DNA模板，采用PCR检测mcr-1基因，试验所用引物见表1。PCR反应体系为：2×PCR mix 12.5 μL，无菌水9.5 μL，上游引物(20 nmol/L) 0.5 μL，下游引物(20 nmol/L) 0.5 μL，DNA模板 2 μL。反应程序为： 94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min， 35个循环;72 ℃ 10 min，4 ℃保存。对mcr-1基因阳性的混合菌样品进行纯化筛选，获得单一mcr-1基因阳性细菌，并通过16S rRNA序列测定、同源性比较鉴定该细菌种属。将纯化后的细菌于-80 ℃冻存备用。

表1 福建猪源mcr-1基因阳性细菌耐药基因检测中所用引物的信息

1.2.2 分离细菌的药物敏感性试验 按照K-B纸片琼脂扩散方法对分离细菌进行药物敏感性试验，并根据CLSI(美国临床和实验室标准协会)第4版(VET01-A4)推荐的方法[10]进行结果判断。使用大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株。计算耐药率(耐药菌株数占mcr-1基因阳性菌株数的比例)。

1.2.3 细菌基因组DNA的提取 复苏细菌，挑取冻存细菌接种于绵羊血琼脂平板，37 ℃培养箱培养过夜；挑取培养后的单个菌落接种于TSB液体培养基，37 ℃摇床振荡培养至菌液在260 nm处吸光度(OD260)为0.6，8 000 r/min离心5 min，弃掉上清，沉淀用PBS重悬后转移到1.5 mL离心管，8 000 r/min再次离心5 min，弃上清，应用细菌DNA提取试剂盒提取沉淀细菌的DNA。

1.2.4mcr-1基因阳性细菌耐药基因的检测 应用PCR方法对如下耐药基因进行检测：磺胺类耐药基因(dfrA1、dfrA3、dfrA5、dfrA7、dfrA12、dfrA、sul1、sul2、sul3)、喹诺酮类耐药基因(aac(6′)-Ib-cr、qepA、qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS)、氯霉素耐药基因(cmlA、fexA、fexB、pexA、Cat1、Cat2、Cat3)、替加环素耐药基因(tet(X)1、tet(X)2)、多黏菌素耐药基因(mcr-1)、金属β-内酰胺酶耐药基因(NDM-1)、多药耐药基因(cfr)、氟苯尼考耐药基因(floR)。PCR所用引物信息见表1。

1.2.5mcr-1基因阳性大肠杆菌的MLST分型试验 参照MLST数据库[11]确定分离细菌ST、反应体系及参数。首先选取与大肠杆菌分型相关的7个管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、MDH、purA、recA)作为目的基因，分别进行PCR扩增与测序，各基因引物来自MLST数据库。反应体系为：TaqPCR Mix 25 μL，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，加双蒸水补足至50 μL。反应参数为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，50～55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，采用胶回收试剂盒回收目的片段，送至福州尚亚生物科技有限公司测序。

将7个不同管家基因序列提交至MLST数据库中进行检索比对，得到每种等位基因的序列号，即序列分型号(ST)。

1.2.6mcr-1基因阳性大肠杆菌的PFGE同源聚类分析 根据美国CDC大肠杆菌标准化实验室PFGE分子分型操作规程[12]，先采用限制性内切酶(XbalⅠ)对细菌基因组进行酶切，然后进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析，使用Gelred染液染色后成像，用BioNumerics软件包(Version 8.0,Applied Maths,Belgium)进行处理，经统一的分子质量标准(分子量标准用沙门菌H9812经过XbalⅠ酶切后的片段)标定条带位置，识别图像条带，必要时进行人工校正。每两个图像之间的相似性系数用Dice系数表示，出现不同条带即判为不同的型别。根据每两个图像之间的相似性系数，用非加权配对算术平均法(unweighted pair-group method using arithmetic averages,UPGMA)进行聚类，构建聚类树。

2 结果与分析

2.1 猪源mcr-1基因阳性细菌的分离与鉴定

福建猪源mcr-1基因阳性细菌分离鉴定结果见表2。由表2可知，从福建省南平、龙岩、三明、平潭、宁德、漳州和福州7个不同地市21个猪场的313份猪粪便中，分离鉴定得到mcr-1基因阳性的细菌共43株，分离率达到13.7%(43/313)，猪场阳性率达到47.6%(10/21)。这43株菌均为肠杆菌科的细菌，其中大肠杆菌39株、肺炎克雷伯菌1株、弗格森埃希菌2株和坂崎肠杆菌1株。

表2 福建猪源mcr-1基因阳性细菌的分离与鉴定

2.2 猪源mcr-1基因阳性细菌的药敏试验

由表3可以看出，mcr-1基因阳性细菌对磺胺类抗生素(磺胺甲基异恶唑)的耐药率最高，达到了90.1%；其次是氟苯尼考、氨基糖苷类抗生素(链霉素)，耐药率分别为83.7%和74.4%；再次是四环素类抗生素(强力霉素)、喹诺酮类抗生素(恩诺沙星)、β-内酰胺类抗生素(阿莫西林)，耐药率分别达到了67.4%，67.4%和53.5%；对头孢噻肟、林可-壮观的耐药率分别达到了39.5%和34.9%；对碳青霉烯类抗生素(亚胺培南)、呋喃类抗生素(呋喃妥因)的耐药率分别只有11.6%和4.6%；对替加环素、利奈唑胺完全敏感。

表3 福建猪源mcr-1基因阳性细菌的药敏试验结果

2.3 猪源mcr-1基因阳性细菌的耐药基因检测

福建猪源mcr-1基因阳性细菌不同耐药基因的检测结果见表4。

表4 福建猪源mcr-1基因阳性细菌不同耐药基因的检出率

由表4可知，磺胺类耐药基因sul1、sul2和sul3的检出率分别达到81.4%，90.7%和74.4%，dfrA12、dfrA7的检出率分别达到62.8%和37.2%，dfrA3和dfrA未检出。喹诺酮类耐药基因qnrS、aac(6′)-Ib-cr的检出率分别达到51.2%和30.2%，qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qepA未检出。氯霉素类耐药基因Cat2、cmlA和pexA的检出率分别达到86.0%，74.4%和34.9%。替加环素耐药基因未检出。氟苯尼考耐药基因floR的检出率为83.7%，金属β-内酰胺酶耐药基因NDM-1的检出率为23.2%，多药耐药基因cfr的检出率为7.0%。

2.4 猪源mcr-1基因阳性大肠杆菌的MLST分型

应用大肠杆菌的7个管家基因序列，对福建39株猪源mcr-1基因阳性大肠杆菌进行MLST分型，结果(表5)发现39株大肠杆菌中，除4株不能分型外，其他35株共分为19个ST型，其中ST10型的菌株最多，共有9株菌，ST29和ST2505各有3株菌， ST156、ST602、ST410和ST101各有2株菌，其他ST型各有1株菌。

表5 福建39株猪源mcr-1基因阳性大肠杆菌的多位点序列分型(MLST)结果

2.5 猪源mcr-1基因阳性大肠杆菌同源性聚类分析

应用脉冲场凝胶电泳分析(PFGE)方法，对福建39株猪源mcr-1基因阳性大肠杆菌菌株进行分型和聚类分析。PFGE图谱(图1)显示，39株菌共获得30种PFGE谱型，具有高度多样性，形成了6组克隆群。ST10型中的6株细菌(菌株编号EC6、EC7、EC8、EC9、EC10和EC11)表现出同一克隆关系，2株ST410(菌株编号EC33和EC37)和2株ST2505(菌株编号EC35和EC38)类型菌株也分别表现出同一克隆关系，但3株ST29型菌株中有1株(菌株编号EC17)与ST117和ST5699类型菌株表现出同一克隆关系。ST10菌株主要分布在福建龙岩地区，其他ST类型菌株没有明显的地域性。mcr-1基因阳性细菌主要分布在福建龙岩和南平地区，在福建省其他地区分布较少。

图1 福建猪源mcr-1基因阳性大肠杆菌的同源聚类结果

3 讨 论

多黏菌素作为一种多肽类抗生素，被认为是治疗革兰氏阴性菌感染的“最后一道防线”[13]。然而，多黏菌素耐药基因mcr-1自从2016年被发现以来[9]，已在全世界多种病原菌中广泛传播[14]，严重影响了该药的临床应用效果[15]。为了防止多黏菌素耐药菌的进一步泛滥，我国在2016年7月份，禁止在饲料中添加多黏菌素，以期降低该抗生素的耐药率；在2020年7月份，禁止在饲料中添加任何抗生素[16]，防止出现无药可用的局面。

本研究在2017-2021年从福建省7个地市采集了313份粪便样品，从中共分离获得43株mcr-1基因阳性细菌，阳性率达到13.7%，其中39株为大肠杆菌，其余4株为肠杆菌科的其他菌属，这与前人相关研究得出的mcr-1基因仅存在于肠杆菌科细菌中的结论[9,17-21]一致。mcr-1基因阳性率偏高的原因是,携带mcr-1基因的细菌可随食物、水环境和土壤进行传播扩散[22-24]。

多黏菌素耐药基因mcr-1的发展趋势自2016年以来，一直受到研究者的广泛关注，而对mcr-1基因阳性细菌的耐药性和耐药趋势却研究甚少。本研究的药敏试验结果显示，磺胺甲基异恶唑、氟苯尼考、链霉素、新霉素、强力霉素、恩诺沙星和阿莫西林的耐药菌率均达到50%以上，且二重或多重耐药现象严重，这是因为这些药物在猪场使用频繁，导致猪源细菌的耐药率居高不下；而亚胺培南、呋喃妥因、替加环素和利奈唑胺的耐药率很低或无耐药性，这是因为这些药物均为人医使用抗生素，而不是兽用抗生素，因此猪源细菌对这些抗生素的耐药率很低。

mcr-1基因阳性细菌的耐药性多种多样，且其耐药机制复杂。为了阐明mcr-1基因阳性细菌的耐药机制，首先必须掌握这些细菌的耐药基因。本研究中，磺胺类抗生素耐药基因sul1、sul2和sul3的检出率较高，均在74%以上；喹诺酮类抗生素耐药基因仅有qnrS和aac(6′)-Ib-cr被检出；氯霉素类抗生素耐药基因中，Cat2的检出率最高，cmlA和pexA也被检出；值得注意的是，氟苯尼考耐药基因floR的检出率高达83.7%，但其在mcr-1基因阴性细菌中的检出率却较低；金属β-内酰胺酶耐药基因NDM-1的检出率达23.2%，这可能是因为饲料中禁用抗生素后，猪细菌性疫病暴发，因此大量头孢类抗生素及其他抗生素被使用，引发了超级耐药菌的出现；多药耐药基因cfr的检出率很低，这与其他研究报道[25]一致。

MLST是一种常用的细菌分子分型方法，在细菌学研究领域应用广泛，具有分辨率高、重复性强、可积累等优势[26-27]。本研究对分离自福建省部分地市的39株猪源大肠杆菌进行MLST分型，除4株细菌不能分型外，其他35株共分为19种不同序列型，这表明同一地市的mcr-1基因阳性大肠杆菌具有高度多样性。在这35株细菌中，ST10型菌株最多，共有9株，其他类型菌株均少于等于3株，可见ST10是优势型。PFGE也是一种微生物基因分型方法，具有重复性好、特异性强、分辨率高等特点，被广泛应用于微生物的分型和溯源[28-29]。有研究以相似性80%作为同一谱型的划分依据[30]，即谱型系数大于80%为有克隆关系，低于80%则视为无克隆关系。本研究PFGE分型结果显示，39株mcr-1基因阳性大肠杆菌分离株共有30种PFGE谱型，表明这些分离株带型具有多态性；且由EC13、EC17、EC34、EC23和大部分ST10菌株(EC6、EC7、EC8、EC9、EC10、EC11、EC3、EC1)组成的克隆群为ST10型菌株占优势的克隆群(ST10克隆群)。EC13(ST5699，龙岩)、EC17(ST29，三明)和EC34(ST117，南平)菌株虽然ST类型不同，但都来源于龙岩的优势克隆群ST10，这可能是因为生猪引种引起了细菌传播[26]。EC5(ST29，龙岩)、EC19(ST29，龙岩)、EC42(未知型，三明)、EC30(ST602，南平)、EC31(ST602，南平)也都具有克隆关系，表明这3地也可能存在同一细菌的互相传播。而不能定型的菌株EC27、EC39和EC43与其他已定型菌株的同源性较差，亲缘关系较远，是3株新发现的分离株。

4 结 论

从福建省分离的猪源mcr-1基因阳性菌株绝大部分为大肠杆菌，只有少部分为肠杆菌科其他细菌。这些分离株分别对磺胺甲基异恶唑、氟苯尼考和链霉素等具有严重的共同耐药特性，尤其是对氟苯尼考共同耐药。mcr-1基因阳性菌株的磺胺类抗生素耐药基因以sul为主，喹诺酮类抗生素耐药基因以qnrS和aac(6′)-Ib-cr为主，氯霉素抗生素耐药基因以Cat2为主。mcr-1基因阳性大肠杆菌的ST类型复杂多样，其中以ST10为优势序列型。PFGE谱型表明，mcr-1基因阳性大肠杆菌带型具有多态性，其在地市的分布也具有高度多样性。