依达拉奉对低氧性肺动脉高压小鼠肺组织TGF-β1及IL-6表达的影响

郑婉，李天发，左琦，魏俊萍，颜亚妮

海南医学院第一附属医院心血管内科，海南 海口 570102

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是由多种临床原因引起的肺动脉压力异常升高的病理生理状态[1]。低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是由于低氧引起的PAH，可导致患者右心室衰竭并最终引发死亡[2]。既往研究表明，氧化应激水平在HPH形成过程中发挥着越来越重要的作用。在HPH的早期时，肺部细胞炎性因子大量分泌，氧化应激增加，当给抗氧化应激药物抑制后，肺动脉高压与肺血管重塑有所改善[3]，表明氧化应激可能参与了HPH的过程，并且对肺血管的重塑有一定作用[4]。依达拉奉是一种强抗氧化剂，可防止氧化应激诱导肌萎缩侧索硬化症患者运动神经元死亡，通常被用于治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)。研究表明依达拉奉可以减弱氧化应激、抑制TLR-4/NF-κB和JAK1/STAT3炎性信号通路并增强机体抗氧化能力[5]。CAI 等[6]的研究发现，转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)及白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)与低氧性肺动脉高压相关，靶向抑制两者可以通过调节肺动脉平滑肌细胞的增殖和凋亡改善肺动脉压。已有研究发现，氧化应激能促进炎性因子的分泌，增加细胞凋亡水平[7-8]。然而调节氧化应激水平是否能改善低氧性肺动脉高压小鼠体内的TGF-β1与IL-6水平进而改善肺动脉高压，目前尚不清晰。

本研究采用依达拉奉治疗低氧性肺动脉高压小鼠，成功降低了其体内的氧化应激，并降低了TGF-β1及IL-6的表达水平，从而了解依达拉奉对于肺动脉高压发展和治疗效果的影响，为低氧性肺动脉高压的临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级雄性C57BL/6J 小鼠(8～10 周龄，20～25 g)由维通利华实验动物技术公司提供，许可证号为SXCK(京)2016-0011。所有小鼠处于自然光暗周期的环境中饲养，室温25℃，实验期间自由饮食饮水。

1.2 主要试剂 依达拉奉注射液购自陕西健民制药有限公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒购自南京建成生物试剂研究所；TRIzol、逆转录试剂盒和SYBR Green试剂购自上海翌圣公司；TGF-β1抗体、IL-6 抗体、Caspase3 抗体、Bcl-2抗体购自英国Abcam公司；HRP 标记的山羊抗兔IgG抗体购自Biosharp 生物科技有限公司；相关qPCR 引物由上海生工合成：GAPDH-F，5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'；GAPDH-R，5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'；TGF-β1-F，5'-CGTGGAAATCAACGCT CCAC-3'；TGF-β1-R，5'-CCACGTAGTAGACGATGG C-3'；IL-6-F，5'-GCCTTCTCTGATGCT-3'；IL-6-R，5'-TGTGACTCCAGCTTATCTCTTGG-3'；Bcl-2-F，5'-AGCATGCGACCTCTGTTTGA-3'；Bcl-2-R，5'-GCCA CACGTTTCTTGGCAAT-3'。

1.3 实验方法

1.3.1 药物毒性实验 随机数表法将同批次40只C57BL/6J小鼠分为0 mg/kg组、20 mg/kg组、40 mg/kg组、80 mg/kg 组，每组10只。每天腹腔注射依达拉奉，持续2周，每2 d观测小鼠活动状态并记录体质量。

1.3.2 动物建模、分组与给药 取C57BL/6J小鼠40 只，适应性饲养一周，随机分为四组，每组10只，依据处理方法不同分为对照组、低氧组、正常治疗组及低氧治疗组。正常组和正常治疗组置于正常环境饲养，而低氧组和低氧治疗组的小鼠均置于氧含量10%的低氧舱，舱内二氧化碳(CO2)由CO2吸附剂清除，连续8周低氧后，通过测量小鼠肺动脉峰值流速、右心收缩压力、右心室厚度，以确定成功构建低氧性肺动脉高压小鼠模型后，给予药物依达拉奉进行治疗。正常治疗组和低氧治疗组每天腹腔注射40 mg/kg 依达拉奉，持续两周，正常组和低氧组给予等体积生理盐水，两周后，收集小鼠的血清和肺组织检测各项指标。

1.3.3 小鼠血清/肺组织中MPO、ROS、MDA的质量浓度与SOD酶活力检测 分别取各组小鼠的血清/肺组织研磨液，根据试剂盒检测说明书所示方法，分别检测ROS含量、MPO、MDA和SOD的酶活性。

1.3.4 RT-qPCR 检测各组小鼠肺组织细胞因子mRNA 的表达 TRIzol 试剂提取小鼠肺组织中的总RNA，酶标仪检测总RNA的纯度和含量。按照RT-qPCR 试剂盒实验说明，依次进行逆转录和RT-qPCR 实验。RT-qPCR反体系：上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 ng，SYBR Primix Ex TaqTM5 μL，ddH2O补充至10 μL。RT-qPCR 反应条件：95℃(30 s)预变性后，变性95℃(7 s)，退火55℃(30 s)，72℃(15 s)，40个循环周期。根据2-△△Ct法计算相对表达量。

1.3.5 Western blot检测各组小鼠肺组织中细胞因子的表达 收集各组小鼠肺组织，使用RIPA裂解提取总蛋白，通过BCA方法进行蛋白定量。样品变性后通过SDS-PAGE 凝胶电泳分离等量蛋白转至PVDF 膜。5%脱脂牛奶室温条件孵育1 h，TBST洗膜5 min，3次，加入TGF-β1抗体(1∶1 000)、IL-6 抗体(1∶1 000)、Caspase3抗体(1∶1 000)、Bcl-2抗体(1∶1 000)，4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜8 min，3次，随后加入HRP标记的羊抗兔的二抗(1∶1 000)37℃孵育1 h，TBST 洗膜8 min，3 次。显影曝光，利用Image-Pro Plus 图像分析系统对蛋白条带的灰度值进行分析。实验重复3次，取平均值。

1.4 统计学方法 应用SPSS19.0 和GraphPad Prism8.0软件进行数据统计分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，组间两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 依达拉奉毒性实验结果 给予小鼠注射不同浓度(0 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg)依达拉奉，1 次/d，持续两周。两周后0 mg/kg、20 mg/kg 和40 mg/kg，三组体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)；与0 mg/kg 组比较，80 mg/kg 组体质量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。结果说明，40 mg/kg 以下剂量浓度对小鼠无明显毒性，故后续实验选择40 mg/kg给药浓度。

图1 梯度浓度依达拉奉对C57小鼠的毒性实验

2.2 依达拉奉改善HPH 小鼠的MPO、ROS 和MDA表达水平 收集4组小鼠血清和肺组织，检测结果显示，与正常对照组比较，正常治疗组小鼠血清和肺组织MPO、ROS、MDA 含量、SOD 酶活力比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较，低氧组小鼠血清和肺组织MPO、ROS、MDA 含量升高，SOD 酶活力降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与低氧组比较，低氧治疗组小鼠血清和肺组织MPO、ROS、MDA 含量降低，SOD 酶活力升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 依达拉奉改善低氧小鼠氧化应激

2.3 依达拉奉有效降低HPH小鼠细胞血清炎性因子因子TGF-β1、IL-6 表达 采用qRT-PCR 和Western blot检测四组小鼠肺组织TGF-β1及IL-6表达情况，结果显示，与正常对照组比较，正常治疗组小鼠肺组织TGF-β1、IL-6 比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较，低氧组小鼠肺组织TGF-β1、IL-6 mRNA和蛋白表达升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与低氧组比较，低氧小鼠治疗组肺组织TGF-β1、IL-6 mRNA和蛋白表达降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图3和图4。采用ELISA 检测四组小鼠血清和肺组织TGF-β1及IL-6分泌情况。结果显示，与正常对照组比较，正常治疗组小鼠血清和肺组织TGF-β1、IL-6含量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较，低氧组小鼠血清和肺组织TGF-β1、IL-6含量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与低氧组比较，低氧治疗组小鼠血清和肺组织TGF-β1、IL-6 含量降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5。

图3 PCR检测各组小鼠肺组织TGF-β1和IL-6 mRNA表达

图4 Western blot检测各组小鼠肺组织中TGF-β1和IL-6 蛋白表达

图5 各组小鼠血清中炎性因子TGF-β1和IL-6浓度水平

2.4 依达拉奉抑制HPH 小鼠肺组织细胞凋亡 采用qRT-PCR 和Western blot 检测四组小鼠肺组织Caspase3及Bcl-2表达情况，结果显示，与正常对照组比较，正常治疗组小鼠肺组织Caspase3、Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较，低氧组小鼠肺组织Caspase3、Bcl-2 mRNA 和蛋白表达升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与低氧组比较，低氧治疗组小鼠肺组织Caspase3、Bcl-2 mRNA 和蛋白表达降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图6和图7。

图6 PCR检测依达拉奉对各组小鼠肺组织Caspase3和Bcl-2 mRNA表达水平

图7 Western blot检测依达拉奉对各组小鼠肺组织Caspase3和Bcl-2 蛋白表达水平

3 讨论

HPH具有发病率高，死亡率高的特点。目前HPH的治疗方法主要有：抑制肺动脉血管平滑肌细胞增殖、改善血管内皮细胞的缺氧状态、逆转肺动脉血管重构、抑制血管收缩因子的作用及间接促进血管扩张物质的形成等。尽管近年来针对HPH 的治疗方法取得了飞速发展，但是目前只有肺移植手术才能根治HPH[9]。因此，寻找可靠的HPH治疗方法仍是研究的热点。

氧气是维持哺乳动物生命所必需的，氧气供应的减少(即缺氧)会改变线粒体ROS稳态并诱导内质网应激[10]。为了应对缺氧应激，细胞会发生适应性反应，这些反应主要由于缺氧诱导因子的激活、线粒体代谢的重编程、ROS 通量增加等[11]所致。缺氧引起的缺氧应激与许多疾病的病理生理有关。HAYASHI 等[12]研究发现，睡眠呼吸障碍患者会表现出间歇性缺氧，导致氧化应激增加，加速动脉粥样硬化和肺动脉高压。另外，暴露于低压缺氧环境中的肺动脉平滑肌细胞的氧化应激水平增加，IL-6水平升高和炎症细胞浸润增加，随后蛋白激酶ERK1/2被激活，导致肺动脉平滑肌细胞增殖并促进低压缺氧引起的肺动脉高压的发展[13]。本实验中发现低氧诱导的小鼠血清和肺组织中的MPO、ROS、MDA 含量升高，SOD 酶活力降低，说明低氧性肺动脉高压导致小鼠肺组织和外周血氧化应激水平升高。依达拉奉具有抗氧化应激和抗凋亡特性，用依达拉奉进行治疗可以消除由镉引起的小鼠氧化应激和炎症反应[14]。之前的研究结果也表明，依达拉奉通过降低血清TNF-α水平来改善新生儿败血症模型中肺动脉高压，表明依达拉奉对肺动脉高压具有一定的治疗作用。本实验发现依达拉奉治疗低氧诱导的小鼠肺动脉高压，依达拉奉可以降低小鼠血清和肺组织MPO、ROS、MDA 含量，提高SOD 酶活力，表明依达拉奉对HPH 小鼠具有降低其氧化应激水平的影响。

随着HPH研究的不断发展，人们发现炎症在HPH中发挥越来越重要的作用，成为了HPH关键病理特征之一[15]。TGF-β1是一种多功能生长因子，具有调节纤维化和免疫的特性[16]。TGF-β1被认为是炎症性肺部疾病发病机制中的重要调节因子，在肺动脉平滑肌细胞，低氧能诱导TGF-β的上调从而介导低氧性肺动脉高压[17]。IL-6 是常见的炎性因子，研究发现，IL-6 通过促进肺动脉平滑肌细胞的增殖参与了肺动脉高压的肺血管重塑过程[18]。本实验结果发现，使用依达拉奉可有效抑制HPH 小鼠组织与血清中的TGF-β1和IL-6的表达水平，表明炎性因子的水平可能受到了氧化应激水平的调节。

此外，有研究显示氧化应激会加速细胞外基质的降解，促使细胞凋亡从而损伤血管内皮细胞[19]。LI等[20]研究发现，在缺氧条件下，肺动脉内皮细胞增殖和凋亡增加，促进肺血管重塑。本实验研究结果表明低氧性肺动脉高压可导致小鼠肺组织Caspase3、Bcl-2 mRNA 和蛋白表达升高，即细胞凋亡增加，当给予依达拉奉治疗后，可明显改善小鼠肺组织损伤，降低其细胞凋亡水平。

综上所述，本研究发现在低氧性肺动脉高压小鼠体内存在较高的氧化应激水平，并且其肺组织中TGF-β1与IL-6表达增加，而使用依达拉奉抑制氧化应激后，可以显著降低上述两个细胞因子的水平。另外实验发现低氧性肺动脉高压小鼠的肺组织中的凋亡水平增加，使用依达拉奉治疗后可降低肺组织细胞凋亡水平。以上实验结果说明氧化应激可能会成为低氧性肺动脉高压的新型治疗靶点，可为进一步探索低氧性肺动脉高压的发生机制提供了理论指导和实验依据。