Wnt通路正调节miRNAs治疗骨质疏松症的研究进展

王小强 谢兴文 徐世红 李鼎鹏 姜朝阳 柳博 张旭明

1. 甘肃中医药大学，甘肃 兰州 7300002. 甘肃省第二人民医院，甘肃 兰州 730030 3. 西北民族大学附属医院，甘肃 兰州 730030 4. 甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是由于骨关系失稳所引起的系统性骨重塑疾病，骨质疏松是骨折的常见危险因素，给老年人带来了巨大的经济压力和负担。骨质疏松症具有骨密度低、骨骼脆性高的特点[1]。据不完全统计，在中国，截止到2016年，50岁以上人群的患病率已接近40%，在疾病谱中紧随心血管发病率之后，位居第二[2]。双能X线骨密度仪(DXA)与骨折风险评估(FRAX)工具相结合，可有效地诊断骨质疏松症[3]。到目前为止，骨质疏松症的治疗仍然有限。治疗骨质疏松症的药物包括选择性雌激素受体调节剂(SERMs)、钙剂、双膦酸盐、维生素D3、甲状旁腺素(PTH)类似物等。然而，长期使用这些药物会带来安全风险，包括多种疾病的发生，例如乳腺癌、子宫内膜癌、心血管疾病和静脉血栓栓塞[4]等。

骨质疏松症最易引起松质骨与密质骨交界部位的骨折。到目前为止，通过对参与骨折愈合的几个主要调控因子的相关研究发现[5]，血管生成被认为在骨代谢[6]中有重要作用。血管生成过程涉及内皮细胞的增殖和迁移、毛细血管的形成和MSCs(间充质干细胞)[7]的稳定等4个过程。已有研究[8]表明，MSCs移植对多种疾病模型均有治疗作用，包括促进成骨和血管生成，通过促进血管生成和成骨细胞可有效调整骨平衡，而在此调节过程中，外泌体发挥着重要作用[9]。

1 外泌体的现代研究

胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由细胞释放到细胞外环境的多种膜囊泡组成，参与细胞间通信[10]。EVs主要有三种亚型:外泌体(exosomes)、微泡(microves)、泡囊(MVs)和凋亡小体(apoptosis bodies)，它们根据大小、功能、含量、生物发生和释放途径表现出不同的特征[11-12]。外泌体是EVs的一种亚型，几乎所有的细胞都能分泌外泌体，外泌体通过内泌体途径形成。外泌体又是多泡体，它的直径通常为30～150 nm，常被包裹在单一的外膜内，通过与质膜融合释放到细胞外空间，同时保护其内容物不被降解。外泌体因其参与细胞因子、mRNA、miRNAs和蛋白质等生化物质的转运，从而通过遗传物质的转移在细胞间通信中发挥关键作用[13]。值得注意的是，外泌体的特定表面配体确保它与靶细胞结合并传递其内容物，最终调节特定的生物学功能。

外泌体起源于内泌体，储存在多泡体(MVBs)中，通过与细胞膜融合释放到环境中[14]。外泌体可以从培养细胞中分离出来，并在体内输送到靶向疾病。因此，一旦其特性和生物学得到更好的描述，外泌体就具有治疗应用的潜力。外泌体中含有大量的蛋白质和脂质，以及以DNA、mRNA、miRNAs和非编码RNA形式存在的核酸物质，因此，外泌体可被细胞作为排泄无用或有害RNA和蛋白质的主要途径。更重要的是，作为向其他细胞传递重要信号的信使和载体，修改其在正常生理和疾病状态下的功能[15]。

外泌体作用广泛，已被用于多种临床研究。研究表明[16]，人脐带间充质干细胞(HucMSCs)衍生外泌体可以减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤。来自干细胞的外泌体可以通过抑制神经元细胞凋亡和促进自噬来促进脊髓损伤后的功能恢复[17]。Bian S[18]等发现MSCs-Exo(间充质干细胞源性外泌体)可以促进心肌梗死模型中的血管生成。同样，Ono M[19]等发现，MSCs-Exo处理细胞后，miR-23b上调，从而通过抑制靶基因标记诱导休眠。抑制标记最终促进了乳腺癌细胞的休眠。Huang L[20]研究表明，MSCs-Exo具有促进血管内皮细胞的迁移和血管内皮生长因子的分泌，从而诱导心脏再生、促进血管生成以发挥改善心脏功能的作用；除此之外，MSCs-Exo还具有抗细胞凋亡、减少心肌梗死面积、改善左心室射血分数和逆转慢性心肌梗死后的重塑、抗炎、抗血管重塑的作用。

2 外泌体中的miRNAs

最近的研究集中于外泌体内容物之一miRNAs，已有研究[21]证明外泌体miRNAs可以对靶细胞发挥调控作用，这是一种新的细胞内信息交流方式。miRNAs是一种包含有22～25个核苷酸的小非编码RNA。越来越多研究表明[22]，miRNAs可介导多种病理生理过程，包括细胞增殖、分化和凋亡。

miRNAs通过介导信号通路可治疗多种疾病，Liu W[23]等证明了活化的HucMSCs释放的mir-126富集外泌体，通过抑制芽状突起相关的结构域包含蛋白1的活性，促进内皮细胞增殖、血管生成和迁移，从而激活信号通路，可促进骨折愈合。在Sun XH[24]等的研究中，发现MSCs-Exo对心肌细胞凋亡有显著保护作用。MSCs-Exo的miR-486-5p抑制心肌细胞中PTEN(抑癌基因)的表达，激活PI3K/Akt(一种胞内磷脂酰肌醇激酶)信号通路，从而抑制心肌细胞凋亡和心肌缺血损伤。Pakravan K[25]等发现，MSCs中转染miR-100能够通过调节信号轴下调乳腺癌细胞中VEGF(血管内皮生长因子)的表达，研究结果支持了外泌体miRNAs可能以旁分泌方式改变乳腺癌细胞功能的观点。Zhang L[26]等指出，含有miR-22-3p的pMφ(腹腔巨噬细胞)外泌体降低了SIRT1(哺乳动物细胞SIRT1)的表达，上调了NF-κB(一种蛋白质复合物，其控制转录的DNA)的表达，提示miR-22-3p可能通过SIRT1/NF-κB通路参与EMS(子宫内膜异位症)，miR-22-3p和SIRT1/NF-κB通路可能作为治疗EMS的新靶点。

既往研究表明[27]，miRNAs是重要的骨密度调节因子，在骨代谢过程中调控骨形成、重构、吸收和细胞分化。例如，miR-140-3p和miR-23b-3p被用作绝经后女性骨质疏松和骨质疏松性骨折的潜在生物标志物。在另一项研究中[28]，miR-221通过影响成骨细胞分化参与骨质疏松症的调控。miRNAs已被鉴定为在分化和发育等生物过程中发挥关键作用。大量研究与骨质疏松症中骨组织和循环生物液中miRNAs表达失调有关[29]。这些研究表明[30]，miRNAs参与了骨质疏松症的发病机制，其治疗潜力应被考虑，因为它们在骨稳态中能够调节多种细胞。因此，确定调控骨质疏松症的重要miRNAs，介导相对应的信号通路，有助于寻找治疗骨质疏松症的新靶点。

3 Wnt信号通路正向调节miRNAs

骨质疏松症的治疗目标是增加皮质骨和小梁骨的质量，并充分改善其微观结构，以预防椎体和非椎体脆性骨折，这可以通过抑制骨吸收和刺激骨形成来实现。大多数抗骨再吸收药物(如双膦酸盐)降低了骨重塑活性，进而降低了骨形成，是治疗时出现的一个不太理想的副作用[31]。因此寻找能够直接或间接促进骨形成的药物，即骨合成代谢疗法应运而生。原则上，合成代谢疗法可以在重塑过程中促进骨形成、通过内衬细胞直接刺激骨形成。骨合成代谢的定义是它们增加了骨形成的能力，通过生物化学标志物如1型氨基末端前肽前胶原(P1NP)或骨骼特异性碱性磷酸酶(BSAP)和组织形态学参数(矿物附着率，MAR和骨形成率，BFR)在骨活检上进行测量。目前，已经确定了两种主要的骨合成通路:甲状旁腺素(PTH)信号通路和典型Wnt(cWnt)信号通路。Wnt信号通路是骨密度的主要调节因子，而甲状旁腺素对其骨关系的调节是通过RANKL(核因子κB受体活化因子受体)产生破骨细胞所形成的，这可能是调节骨稳态、治疗骨科相关疾病的另一潜在靶点[32]。

Int-1是1984年发现的一种致癌基因，与小鼠的乳腺癌发病有关[33]。1976年[34]研究发现了一个无翅果蝇同源基因片段极性基因。这个同源物被发现与int-1相同，因此Wnt(wingless-related MMTV integration site)被命名为wingless和int-1[35]。随后，Wnt受体，一种低密度脂蛋白相关受体5(low-density lipoprotein-related receptor 5,LRP5)，在2001年被证明参与了骨量调控，Wnt信号通路受到了广泛关注，其功能开始被大力研究[36]。成骨细胞产生骨基质蛋白，其总寿命为2～3个月。它们最终会凋亡，停留在骨表面作为骨内衬细胞，嵌入自分泌的骨基质蛋白中，或分化为骨细胞[37]。成骨细胞来源于未分化的间充质细胞，间充质细胞也分化为软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和成纤维细胞。祖细胞向组织特异性细胞的分化受到组织特异性转录因子的调控。在确定细胞分化之前，Wnt蛋白抑制成骨前体细胞凋亡，从而促进成骨细胞分化；此外，通过基因敲除和转基因小鼠的进一步阐明了促成骨的转化，研究发现Wnt抑制了间充质干细胞向脂肪细胞的分化，促进间充质干细胞自身的分化，从而促进了骨生成和增加骨量，Wnt通路的激活促进成骨的转化[38]。这些结果表明，典型的Wnt通路在间充质干细胞向成骨细胞分化过程中至关重要。

Wnt通路促进了间充质干细胞分化，骨髓来源的间充质干细胞是可靠的外泌体生产者，Wnt通路的这一促进作用保证了外泌体的广泛来源，而MSCs-Exo可作为基于小分子RNA的体外和体内治疗的合适纳米载体。横向看这一过程，笔者认为，Wnt通路通过促进间充质干细胞分化，正向调节了外泌体内容物之一miRNAs的产生。

4 Wnt通路与miRNAs治疗骨质疏松症

研究表明[39]，表达miR-409-5p可抑制成骨细胞分化，而通过抗miR-409阻断miR-409-5p的表达可促进成骨细胞功能和基质矿化。通过表达miR-409-5p，可以观察到典型的Wnt/βcatenin信号通路受到抑制。在切除卵巢的雌激素缺陷小鼠中，miR-409-5p的沉默可以恢复骨小梁微结构的丧失并抑制骨吸收。因此，靶向miR-409-5p可能有助于增加绝经后骨质疏松症等情况下的骨密度。某些miRNAs已被鉴定与Wnt信号分子相互作用来调节成骨。Liu TJ[40]等发现miR-141过表达显著上调了去卵巢诱导的骨质疏松大鼠下颌骨中Wnt2和β-catenin的表达。为了进一步探讨miR-141对Wnt/βcatenin通路的影响，通过使用Wnt激动剂重组DKK2蛋白和Wnt抑制剂重组人内皮抑制素。结果表明，在去卵巢诱导的骨质疏松大鼠下颌骨中，miR-141过表达可激活Wnt/β-catenin信号通路[39]。

Li L[41]等的研究证实，随着成骨细胞分化的进展，MC3T3-E1(小鼠胚胎成骨细胞)细胞SP1(转录因子)表达下调。典型的Wnt信号通路即Wnt/b-catenin通路已被证实在调节骨稳态中发挥重要作用。值得注意的是，激活该通路有助于成骨分化，而抑制该通路则会诱导破骨细胞分化。本文也证实了分化成骨细胞中Wnt/b-catenin信号通路被明显激活，miR-545-3p通过抑制该通路限制成骨细胞分化。更重要的是，解释了miR-545-3p对Wnt/bcatenin通路的抑制作用是由LRP5介导的。miRNAs通过参与激活Wnt信号通路促进MSCs的成骨分化，抑制MSCs向成软骨、成脂肪谱系分化，阻止成熟成骨细胞凋亡，抑制破骨细胞分化，可预防骨质疏松症的发生[42]。

5 总结与展望

本文发现miRNAs参与了多种信号通路，包括Wnt、MAPK、Hippo通路等。激活Wnt信号通路可促进MSCs的成骨分化，激活MAPK信号通路可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，维持成熟成骨细胞的存活，抑制破骨细胞的分化[43]。Hippo信号通路可维持骨质疏松症[44]患者MSCs存活。这些研究表明，miRNAs通过调控Wnt、MAPK、Hippo等信号通路在骨质疏松症中发挥重要作用。LRP5作为Wnt蛋白的辅助受体，是公认的Wnt/b-catenin信号的激活因子。LRP5在骨形成中的正向调节作用也已被证实[45]。笔者认为，在LRP5激活Wnt/b-catenin信号的同时，以某种方式将其与miRNAs、血管生成这三者相结合起来应用于临床，可能会成为治疗骨质疏松症的一种新思路。