记忆CD8+ T 细胞相关免疫治疗在肝细胞癌中的研究进展

张小余 徐细明

武汉大学人民医院肿瘤中心肿瘤三科，湖北武汉 430000

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原发性肝脏肿瘤的75%～90%[1]，不仅是最常见的原发性肝癌类型，也是当前全球第六大最常见的癌症，也是癌症死亡相关的第四大原因[2]。HCC 发生、发展与细胞免疫反应密切相关[3]，故HCC 患者预后与免疫细胞浸润程度呈显著正相关[4]。在T 细胞各个亚群中，终末分化效应T 细胞（terminally differentiated T cells，TEFF）因其强大的细胞毒性，最初被认为是主要的抗肿瘤免疫细胞，但越来越多的证据提示记忆CD8+T 细胞才是维持长期癌症免疫效果的重要细胞[5]。有研究指出，HCC 患者的记忆CD8+T 细胞比TEFF 更易被募集到HCC 部位[6]，且部分记忆CD8+T 细胞亚群是HCC PD-1 治疗的主要效应细胞，其含量与HCC 进展呈正相关[7]。此外，记忆/静息T 细胞也有助于预测肝外转移，是HCC 移植患者显著的独立预后因素[8]。从功能上分析，部分记忆CD8+T 细胞分泌γ 干扰素、白介素（interleukin，IL）-33、穿孔素和颗粒酶能显著诱导HCC 细胞凋亡，从而改善患者预后[9]。本文主要概述记忆CD8+T 细胞在HCC 的发生、发展中所起的作用，总结了其相关免疫治疗的研究进展，也为新的HCC 免疫治疗提供证据支持。

1 细胞分型与功能

记忆CD8+T 细胞主要有以下4 个亚型[10]：干细胞性记忆T 细胞（stem cell memory T cells，TSCM）分布于初级和次级淋巴器官，有着幼稚表型（CD45RA+CCR7+CD27+）和记忆细胞特点（CD95+CXCR3+IL-2Rβ+CD58+CD11a+）；中央型记忆性T 细胞（central memory T cell，TCM）和记忆T 细胞（effector memory T cell，TEM）均有着记忆细胞特点，但在记忆细胞表型上有所不同（CD45RO+CCR7+CD27+和CD45RO+CCR7-CD27-），两者区别在于TEM 不表达使细胞向淋巴归巢的CCR7 和CD62L，故TEM 分布不像TCM 细胞一样集中于初级和次级淋巴器官，而是大量参与血液循环；常驻记忆T 细胞（resident memory T cell，TRM）表型近似于TEM，但其表达黏附因子CD69 或CD103，因此能常驻于肝、肺、脑等器官中维持免疫。经典的分化路径认为，TSCM 来源于幼稚T 细胞的直接分化和幼稚T 细胞分化的TEFF 的去分化，它不仅能自我更新而且能分化为TCM，TCM 在保留部分免疫效应能力的同时，则能够进一步分化为TEM 和TRM，发挥巨大的免疫效应能力。TSCM 的抑癌作用依赖分化的TCM 和其强大的自我更新能力[11]。TCM 的抑癌作用则主要依赖于其分化的TEM 和TRM，后两者都能分泌大量的穿孔素和颗粒酶及细胞因子发挥抑癌作用[12]。具有组织特异性的TRM 能够招募TEM 细胞[13]，而TEM 在经历终末分化后细胞表型类似TEFF，具有更强的分泌穿孔素和颗粒酶的能力[14]。

2 过继免疫治疗（外源性）

鉴于记忆CD8+T 细胞的重要免疫功能，以之为载体能显著改善过继免疫治疗效果。TEFF 细胞发现之初被认为是最有效的过继免疫治疗载体，但进一步研究提示其作为载体细胞效果并不佳，而TEM 为载体的治疗较TEFF 细胞效果有明显提升[15]。黑色素瘤过继免疫治疗载体研究进一步说明，作为载体的TEM分化程度越低，则抗肿瘤免疫的效果越好，持续时长越长[16]。

T 细胞为主要载体的过继免疫治疗包含了肿瘤浸润免疫细胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）治疗、工程化T 细胞受体修饰的T 细胞（T cell receptorengineered T cell，TCR-T）治疗和嵌合抗原受体T 细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）治 疗。CAR-T 治疗因其广阔的治疗前景在HCC 中受到最多的研究，目前有多项临床试验正在进行。TSCM（NCT03288493、NCT00586391、NCT00709033）是目前在血液系统肿瘤进行临床研究的CAR-T 载体细胞，以之为载体或许能为HCC 的CAR-T 治疗带来新的启发。

2.1 TIL 治疗

作为一种有潜力根除肿瘤的个体化疗法，TIL 治疗主要过程为离体扩增自体肿瘤浸润免疫细胞并回输，故其在HCC 患者中应用的关键在于识别有持久免疫作用的细胞。CD45RO+T（记忆细胞标志）细胞经细胞流式分析被识别为HCC 肿瘤浸润免疫细胞的主要类型[17]。Di Blasi 等[18]进一步指出，HCC TIL 细胞中有50%以上表达CD69（TRM 的表面标志之一），提示TRM 细胞可能是主要的TIL 细胞。此外，CD8+TEM在HCC 免疫浸润细胞中也是极为重要的一类。CD8+KLRG1+CD107a+TEM 细胞在HCC 组织之中的浸润与HCC 预后呈正相关[19]，而CD8+CD45RO+CD95+TEM亚群细胞显著上调抑制免疫因子PD-1、CTLA-4 和TIM-3，从而促进肿瘤的生长[20]。以上研究提示了不同记忆CD8+T 细胞亚群在HCC 中作用，与主要分布外周淋巴器官的TCM 和TSCM 比较，TRM 和TEM 是记忆CD8+T 细胞中更适宜TIL 治疗的细胞。其中TRM作为HCC 中TIL 的主要细胞亚群，不但能够诱导后去分化为保留嗜肝性的TCM[21]，而且存在长寿的TRM细胞群[22]，可能是目前最适合HCC 的TIL 治疗细胞。

2.2 TCR-T 治疗

T 细胞受体（T cell receptor，TCR）能够与T 细胞表面的CD3 非共价结合，识别相容性复合物呈递的肽链，从而识别体内癌症细胞，通过对其进行基因工程改造，能更加有效地识别和杀伤癌细胞，改善患者预后。目前已经有研究指出，HLA-A2/AFP158 TCR 能够特异识别HLA-A2+AFP+HepG2 HCC 肿瘤细胞并产生效应细胞因子，产生显著的杀伤而对正常细胞并无显著影响[23]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）-TCR 也能识别HCC 细胞内HBV 蛋白，显著的缩小HBV 肝癌患者的瘤体体积[24]。除了选择特异的TCR 靶点提升疗效，载体选择也十分关键，但由于缺乏HCC TCR-T 治疗的载体研究，以其他肿瘤的载体研究或许能带来新的启发。不同于源自TEM 的CD8+T 细胞，TCM 来源的CD8+T 细胞具有恢复到记忆细胞库的能力，因而较TEM 细胞的过继免疫治疗有着更加持久和强烈的作用[25]。一项平均随访时间为6 年的研究进一步指出，记忆CD8+T 亚群显著影响淋巴瘤患者时的TCR-T 细胞含量：TSCM 与TCR-T 细胞含量显著相关（R2=0.9714），TCM 与之弱相关（R2=0.2177），而TEM 与之无相关性（R2=0.0031）[26]。总之，利用低分化的TEM 亚型为载体，可能使得TCR-T 细胞在HCC患者体内存活时间更久，从而更好地抑制HCC的发生、发展，使患者得到更大的生存获益。

2.3 CAR-T 治疗

CAR-T 治疗不受相容性复合物呈递过程的约束，杀伤癌症细胞较TCR-T 治疗更为高效，应用也更多。HCC 的CAR-T 治疗目前已存在多项临床前和临床研究[27-28]，提示这是一项具有巨大潜力的治疗模式。目前CAR-T 在临床试验的HCC 免疫抗原主要有GPC3（NCT02715362、NCT03130712、NCT03084380）、CD133（NCT02541370）、MG7（NCT02862704）和CD147（NCT03993743）。类似TCR-T 治疗，载体细胞的选择对于HCC 的CAR-T 也尤为重要，如前述，较低分化的免疫细胞能在体内有着更长效和强烈的免疫效应，故TSCM 是最有潜力的CAR-T 载体细胞，以TSCM 为载体能显著增加CAR-T 对于霍奇金淋巴瘤和白血病患者的疗效[11]。Xu 等[29]研究显示，TSCM 含量的提升使得B 细胞淋巴瘤患者体内CAR-T 细胞含量大幅跃升，而且使得CAR-T 细胞在小鼠移植瘤内存在时间大幅延长，并且在人体和动物实验中都能定植到初级淋巴器官中发挥长期抑癌作用。Huang 等[30]HCC 临床前研究提示，IL-7+CCL19+GPC3 CAR 的治疗能显著提高TSCM 含量，有着更强的增殖、趋化能力，能显著清除免疫缺陷小鼠体内的移植GPC3+HCC。综上，以TSCM为载体的CAR-T 能给HCC 治疗带来新的突破，从而给HCC 患者带来更多获益。

3 其他相关免疫治疗（内源性）

基于TEM 的重要作用，通过影响关键位点进而改变其在HCC 中含量，能显著提升肿瘤的治疗效果。脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白1（poliovirus receptorrelated 1，PVRL1）能够显著地稳定细胞表面的脊髓灰质炎病毒受体含量，后者通过与TEM 表面的抑制分子T 细胞免疫球蛋白和ITIM 结构域蛋白（T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，TIGIT）作用从而解除TIGIT 诱导的免疫抑制效应，上调PVRL1 和抗PD-1 联合能显著改善小鼠HCC 预后[31]。共济失调毛细血管扩张症和Rad3 相关蛋白（ataxia telangiectasia and Rad3-related protein，ATR）受抑制剂AZD6738 的抑制从而上调cGAS/STING 通路，继而升高TCM 和TEM 含量，提高HCC 抗PD-1 治疗及放射治疗的效果[32]。组蛋白去乙酰化酶8（histone deacetylase-8，HDAC8）被选择性抑制剂PCI-34051 抑制后能够显著升高H3K27ac，从而导致HCC 启动子的整体乙酰化水平升高，使得包括T 细胞趋化因子家族在内的一系列抑癌基因表达水平升高，从而升高包含TEM 和TCM 在内的CD8+T 细胞数量及降低Treg细胞数量，显著抑制了裸鼠移植瘤的增长，且维持了强效的二次免疫[33]。在小鼠肝移植瘤模型中，舒尼替尼通过抑制由射频消融激发的肝细胞生长因子含量从而升高TCM 和TEM细胞的含量，进而抑制肿瘤的生长[34]。抗信号转导子和转录激活子3 能够通过体液免疫和细胞免疫显著地改善预后，且能够通过激活TEM 形成二次免疫[35]。此外，经计算机优化抗原表位的HCCAFP 疫苗[36]，显著地诱导了TEM 的表达，显示了较野生型HCC 疫苗具有更好效果。另一方面，正如TRM 细胞在肺癌和黑色素瘤中展现的对于免疫检查点抑制剂治疗良好反应[37]，作为HCC 中主要的免疫浸润细胞，PD-1+TRM是HCC 抗PD-1 治疗的主要反应亚群，其数量随着HCC 进展明显减少[7]。总体上来讲，认识以上靶点影响记忆CD8+T 细胞含量过程可能有助于HCC 临床治疗决策。

4 总结

记忆CD8+T 细胞是肿瘤免疫中至关重要的环节，针对含免疫检查点在内的靶点能够影响HCC 内的TCM、TEM 和TRM 的含量和功能，从而获得长期的HCC 免疫。尽管诸多实验停留在动物阶段，但相关治疗靶点如TIGIT、PVRL1、ATR 等在多种肿瘤均有效。从各亚型来讲，TSCM 细胞在血液系统肿瘤中有着良好的抗肿瘤免疫效果，持续反应时长，虽然在HCC 中缺乏足够证据，但现有临床前研究初步提示其治疗潜力，有望给HCC 的TCR-T 和CAR-T 治疗带来新的突破。TCM 因其相对TSCM 更丰富的含量，获取难度更低，临床治疗可能也更加容易实现。TRM 不仅是目前最适合TIL 治疗的细胞，其表达免疫抑制分子的亚群也是HCC 免疫检查点治疗的重要靶点。TEM 尽管不是最佳的过继免疫治疗载体细胞，但部分TEM 亚群免疫抑制分子水平的显著升高，可能会在免疫检查点治疗之中获益。以上内源性和外源性记忆CD8+T 细胞治疗对于HCC 治疗都有着巨大潜力。在激发内源性免疫的同时，使用记忆CD8+T 细胞载体的过继免疫治疗可能会给HCC 患者带来更大的生存获益。