磷酸赖氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸盐磷酸酶在肿瘤中作用的研究进展

汤 翔 王景芝 刘 娜 陈德玉

1.江苏大学附属医院肿瘤科，江苏镇江 212001；2.江苏省盐城市第一人民医院放疗科，江苏盐城 224001

在肿瘤细胞中，蛋白翻译后修饰的研究越来越成熟，其与肿瘤微环境及肿瘤代谢等的关系正被一步步揭示[1-3]。磷酸化作为生物体内最常见、最广泛的修饰之一，其调节异常在某些疾病的发生中起重要作用。目前已知的可以发生磷酸化修饰的天然氨基酸共有9 种（包括组氨酸），但是受限于组氨酸磷酸化的不稳定性和检测技术等原因，关于组氨酸磷酸化修饰的研究相对较少。Hindupur 等[4]最新的研究发现在肝癌的发生发展中，组氨酸激酶（non-metastatic clone 23rd，NEM）明显上调，磷酸赖氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸盐磷酸酶（phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate ph-osphatase，LHPP）明显下调，二者的变化共同导致了肝癌细胞中组氨酸磷酸化水平的升高，并促进了肝癌的发生和发展。该研究表明了组氨酸磷酸化与肿瘤发生发展的关系，而在调控组蛋白磷酸化水平中发挥重要作用的LHPP，无疑是其中的关键。本文阐述了LHPP 的结构、功能及其与肿瘤的关系。

1 LHPP 的生物学结构和功能

1.1 生物学结构

LHPP 是一类含卤酸脱卤酶样水解酶结构域基因家族成员，编码该蛋白的基因位于人类第10 号染色体（q26.3）上，包含3 个外显子和1 个82 bp 的非编码区，是一种分子量为13.7 kD 的蛋白，主要由3 个亮氨酸拉链结构域组成，酶活性位点在22 位的半胱氨酸残基，广泛表达于脑、肾、肝等组织中[5-7]。LHPP 最先由Lohmann 于1928 年在肌肉组织中首次发现，并由Seal[8]于1950 年在哺乳动物神经组织中发现。该酶的最适pH 值为7.6～7.8，可被半胱氨酸、谷胱甘肽等活化，而某些金属离子和对氯汞聚苯甲酸盐等可抑制其活性[9]。

1.2 功能

LHPP 可以介导组氨酸的去磷酸化从而发挥一系列的调节作用。LHPP 可使组氨酸去磷酸化，从而抑制以磷酸化组氨酸作为中间体的一系列酶的活性，包括核苷二磷酸激酶、磷酸甘油酸突变酶（phosphoglycerate mutase 1，PGAM1）、磷脂酶D（Phospholipases D，PLD）等相关酶的活性，但LHPP 直接作用于哪种底物有待进一步探究。有学者报道人体内存在着比无机焦磷酸盐更合适的底物，可能是含有磷赖氨酸和/或磷组氨酸的磷蛋白[10]。LHPP 可以通过诱导组氨酸去磷酸化使八聚体结合转录因子4 和左右决定因子1 明显下调，并使细胞停留在G0/G1期，从而参与调控细胞周期和细胞分化。最近的研究表明，LHPP 可以调控肿瘤细胞的上皮间充质转化[11]。

2 LHPP 与肿瘤

肿瘤的综合治疗越来越得到重视，恶性肿瘤患者的生存率明显上升，但中晚期患者综合治疗后的5 年总生存率仅为25%～30%，且这些治疗往往伴随着高度不良的副作用[12-13]。恶性肿瘤早期往往缺乏特异性临床表现及相关指标，多数患者初次就诊时已为中晚期，这导致恶性肿瘤成为了一类高病死率疾病。根据国际癌症研究中心《2020 全球癌症报告》报道，当前恶性肿瘤的发病率正呈逐年上升的趋势，预估到2040 年，世界每年新发癌症人数将多达2700 万例。因此，寻找肿瘤早期的筛查指标，以及探寻肿瘤新的治疗靶点，无疑是目前肿瘤研究中的重中之重。目前已有大量的研究证实肿瘤的发生发展与细胞信号转导通路的异常活化有关，其中最重要的信号通路包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信号通路（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinases B，PI3K/Akt）、丝裂原活化蛋白激酶信号通路（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路等[14-15]。这些通路的异常活化共同导致了肿瘤的增殖、分化、凋亡等异常，从而打破了原癌基因和抑癌基因的平衡，促进了肿瘤的发生发展。而引起这些通路异常活化的原因复杂多样，限制了这些信号通路在肿瘤诊疗方面的应用。最近，雷帕霉素受体（mammalian target of rapamycinm，mTOR）信号通路的发现者通过蛋白质组分析发现了一种新的抑癌蛋白-LHPP，该蛋白的缺失显著促进了PI3K/Akt/mTOR信号通路的磷酸化活化，从而促进了肝癌的发生发展[4]。与组氨酸磷酸酶的另外2 个成员作用于1-磷酸组蛋白不同，LHPP 主要作用于3-磷酸组蛋白，其与组氨酸激酶共同调控组氨酸残基的磷酸化与去磷酸化，进而周期性调控细胞内部分酶的活性，并保证了细胞对外界信号的持续反应和级联放大效应[16]。而LHPP 的异常缺失则导致了蛋白质磷酸化修饰的异常，引起部分信号通路的异常活化，进而导致细胞周期蛋白、凋亡蛋白的异常，促进肿瘤的发生发展。除了肝癌以外，随后的多项研究证实LHPP 的缺失还参与了其他肿瘤的发生发展。包括胰腺癌、结肠癌等消化系统的其他肿瘤[17-19]、膀胱癌等泌尿系统肿瘤[20]，以及黑色素瘤[21]、非小细胞肺癌[22]、甲状腺乳头状癌[23]、口腔癌[24]、宫颈癌[25]等。结合LHPP 主要在肝、脑、肾等组织中高表达及研究现状，本文在探讨LHPP 与恶性肿瘤的关系的同时将重点探讨LHPP 与肝癌、胶质瘤、肾癌、结直肠癌、前列腺癌的关系。

2.1 LHPP 与肝癌

肝细胞癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，具有较高的发病率和死亡率，肝癌发病率每年增加约70 万例，中国肝癌发病率居世界首位[26]。目前主要的治疗方式是外科手术及肝移植。然而，由于肝癌细胞易发生转移，这些治疗方案往往不能获得预期的效果[27]。因此，寻找肝癌治疗的新的有效靶点，成为肝癌临床诊疗急切需要解决的问题。在肝脏特异性缺失同源性磷酸酶-张力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）和TSC 复合亚单位1（TSC complex subunit 1，TSC1）的L-dKO 肝癌小鼠模型中，Hindupur 等[4]最先报道LHPP 作为一种抑癌蛋白，其缺失促进了小鼠肝癌的发生，此外，通过追踪研究发现，LHPP 表达较低的患者无病生存期和中位生存期较LHPP 表达较高的患者减少了近2 年，差异有统计学意义（P＜0.05）。Liao 等[28]进一步证实，LHPP 在人肝癌细胞株中表达明显降低，该酶的缺失上调了细胞周期蛋白B1、M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase isozyme type M2，PKM2）、基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）7 和MMP9 等细胞周期相关蛋白的表达，从而促进了肝癌细胞的分裂增殖。而引起上述蛋白上调的机制正是通过Akt/p65 信号通路的磷酸化实现的。值得注意的是，此前有研究报道，LHPP 的缺失可通过抑制PKM2 的泛素化降解，从而长时间维持PKM2的活性[29]。因此，笔者推测，LHPP 除了通过调控组氨酸残基的磷酸化发挥一系列生物学作用外，其也可能通过调控蛋白质泛素化修饰在肿瘤信号通路的调控中发挥重要作用。Tian 等[30]、Yan 等[31]则报道LHPP 在人肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织，并且受微小RNA-765、微小RNA-363-5P 的负向调控，但具体机制尚不明确，仍需深入研究。更为重要的是，肝癌发展往往遵循肝炎-肝硬化-肝癌三部曲的规律，Gong 等[32]发现在阻断了LHPP 作用的3-pHis 位点后，NEM1 可通过转化生长因子β/Smad 相关蛋白（transforming growth factor-β/Smad，TGF-β/Smad）途径促进肝纤维化的发生，对该阶段进行干预，可显著降低肝癌的发生率。这些学者的研究从细胞、组织、动物模型等多方面证实了LHPP 与肝癌发生发展的关系，并为肝癌的筛查治疗提供了新思路，即是否可以将LHPP 作为肝癌早期筛查的指标和治疗的潜在靶点，通过合成重组人LHPP 蛋白促进肝癌细胞的凋亡，从而达到治疗肝癌的效果，至于LHPP 是否可以协同提高肝癌的靶向治疗、免疫治疗的效果，将是LHPP 在肝癌领域中的重点研究方向。

2.2 LHPP 与胶质瘤

胶质瘤的发病率在脑部恶性肿瘤中居于首位，全世界胶质瘤的发病率呈上升趋势[33]。据Yang 等[34]统计，2005—2018 年中国胶质瘤的发病率和死亡率呈明显上升趋势，且患者的总生存期仅为10～15 个月[35]。Li 等[36]首先通过生信分析发现LHPP 在胶质瘤患者的肿瘤组织中的表达显著低于癌旁组织，并进一步证实LHPP 在U251MG、U87MG、U138MG 等胶质瘤细胞系中的表达也明显低于正常神经细胞，LHPP 可通过抑制Akt 磷酸化，从而下调磷酸化葡萄糖合成激酶3β，导致细胞外因子/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路失活，从而促进细胞凋亡，抑制胶质瘤的发生发展。Chen 等[29]则选取了10 对胶质瘤患者的肿瘤和癌旁组织，通过蛋白免疫印迹实验发现LHPP 在6 对肿瘤组织中的表达明显低于癌旁组织。紧接着，Chen等[29]通过对94 例胶质瘤组织进行免疫组化检测，发现59 例患者为免疫组化低分组，35 例为免疫组化高分组，且Ⅳ级胶质瘤患者的得分明显低于Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤患者，进一步通过生存分析发现了LHPP 缺失的患者中位生存期较LHPP 高表达的患者减少4 年，这共同提示LHPP 的缺失与胶质瘤的分期和级别和生存期有关。同时，通过细胞成像及细胞克隆形成试验进一步证实，过表达LHPP 的可显著抑制U87MG和U118-MG 细胞株的生长，体内实验也表明过表达LHPP 可抑制小鼠胶质瘤的生长和转移[29]。为探明LHPP 抑制胶质瘤生长的机制，Chen 等[29]通过质谱分析和KEGG 途径分析表明，在相关性最高的10 条途径中有3/10 与能量代谢过程有关，包括碳代谢、氧化磷酸化和糖酵解，而PKM2 是参与糖酵解和碳代谢的蛋白质中与LHPP 相关性最高的蛋白。PKM2 在糖酵解的最后一步起到将磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate 或phosphoenolpyruvic acid，PEP）转化为丙酮酸的作用[37]。PKM2 包括单体、二聚体和四聚体3 种亚型。单体PKM2 为非活性状态。二聚体PKM2 促使葡萄糖衍生碳向糖酵解方向移动。而四聚体PKM2促使葡萄糖衍生的碳向呼吸链方向移动[38]，在肿瘤的代谢重编程中发挥重要作用。而LHPP 通过诱导泛素介导的PKM2 降解，引起胶质瘤细胞内丙酮酸、乳酸水平和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成的降低，并降低线粒体氧化呼吸速率，阻碍能量代谢过程中的糖酵解和呼吸作用，从而抑制胶质母细胞瘤的生长[29]。在胶质瘤中，LHPP 发挥抑癌作用的机制被进一步揭示，LHPP 的缺失通过促进胶质瘤的代谢重编程参与了胶质瘤的发生和发展，并通过活化Wnt/β-catenin 信号通路参与了胶质瘤的生长和转移，这提示LHPP 可能作为胶质瘤的分期、预后指标和未来治疗的新靶标。同时，Faubert 等[39]的研究也为LHPP的研究方向提供了一个新思路，即LHPP 除了目前已知的在细胞周期及信号通路等方面发挥抑癌作用外，在肿瘤的代谢重编程方面也产生了重要作用。代谢重编程是肿瘤的一个标志，指包括糖酵解和线粒体代谢在内的整个代谢网络的转化，主要表现为Warburg 效应和线粒体代谢重编程，与肿瘤的生长增殖和免疫逃逸等均密切相关。因此，通过重组LHPP 蛋白联合对增强肿瘤对葡萄糖依赖性的蛋白如谷氨酸/胱氨酸反向转运体（glutamate/cystine antiporter solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）激动剂以促进肿瘤的死亡可能是LHPP 在胶质瘤研究中值得重点探究的方向。

2.3 LHPP 与肾癌

肾癌是发病率和死亡率最高的十大癌症之一，早期肾癌患者的5 年生存率可高达90%，但晚期肾细胞癌患者的5 年生存率骤降至10%[40-41]。大约25%的肾癌患者在初次诊断时便已经进展到晚期[42]。因此，发现肾癌早期新的筛查指标，和晚期肾癌的新的治疗方法，对降低肾癌的死亡率尤其重要。Zhang等[43]通过qRT-PCR 方法检测72 例患者的肾癌组织和癌旁组织发现，其中45 例患者肿瘤组织中LHPP mRNA 水平较癌旁组织明显下调，占比达62.5%。而细胞实验进一步证明，在过表达LHPP 后，减缓了786-O 和769-P 肾癌细胞株的生长曲线，划痕实验显示相对迁移率分别降低了46%和58%，在沉默LHPP 后，则明显促进了该细胞的生长增殖和迁移。更为重要的是，该研究还表明LHPP 的缺失与肾癌患者的肿瘤大小和术后的复发呈正相关[43]。Meng 等[44]同样发现LHPP mRNA 在肾癌组织中较癌旁组织下调，还通过蛋白免疫印迹法证明LHPP 的蛋白表达在肾癌组织中也显著低于癌旁组织。进一步生存分析发现，与LHPP水平低的肾癌组织相比，LHPP 表达水平较高的患者具有更高的总体生存率和中位生存期。该项研究还报道在过表达LHPP 后，可下调肾癌细胞中N-钙黏蛋白、β-连环蛋白、波形蛋白的表达，上调E-钙黏蛋白的表达，抑制肾癌细胞的上皮间充质转化，从而抑制其转移。同时，过表达LHPP 可降低B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表达，上调Bcl-2 相关X蛋白和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的表达，从而促进肿瘤细胞的凋亡。不可忽视的是，Meng 等[44]还发现microRNA-765、microRNA-21、microRNA-144 与LHPP 呈相关，二者可协同作为肾癌的预后指标。一直以来，肿瘤术后的复发和转移都是肿瘤治疗的重点和难点，笔者认为LHPP 可能成为监测肾癌、甚至其他肿瘤复发的重要指标，但由于LHPP 主要定位为细胞质中，检测存在限制，而microRNA 主要存在于血清中，将LHPP 和microRNA-765、microRNA-21、microRNA-144 协同作为肾癌患者的早期筛查和术后复发的预测指标，可以取得更好的效果。同时开发针对LHPP 的药物，不仅可以作为肾癌患者的新的治疗手段，也可以在降低肾癌术后复发率方面发挥重要作用。但鉴于LHPP 目前作用的底物尚不明确，开发像西妥昔单抗的受体结合抑制剂存在困难，更好的策略可能是针对LHPP 所调控的组氨酸磷酸化位点开发相应的磷酸激酶抑制剂。

2.4 LHPP 与结直肠癌

结直肠癌具有初诊分期晚、发展快、转移迅速等特点，是全球第三大癌症相关死亡原因[45]。因此，探究结直肠癌转移的相关机制，寻找新的治疗靶点是结直肠癌临床诊疗工作中亟须解决的问题。Hou 等[17]首先通过TCGA 数据库分析发现，相较于正常组织，LHPP在结直肠癌中表达普遍缺失，并通过对52 个结直肠癌患者组织的免疫组化分析证实LHPP 蛋白质水平在结直肠癌样本中显著低于癌旁组织，且与结直肠癌的TNM 分期和临床分期呈显著、负相关，但与患者的总体生存率无关。进一步的细胞实验发现，在靶向沉默结肠癌HT-29 细胞系LHPP 的表达后，本底的PI3K 及其酪氨酸467 位点的磷酸化和本底的Akt 及其丝氨酸473 位点的磷酸化水平均明显上调，并促进了肿瘤细胞的侵袭转移。Hou 等[11]的另一项研究发现，在LHPP 过表达的结肠癌Caco2 和SW480 细胞株中，TGF-β/Smad3 信号通路的活化被抑制，EMT 相关蛋白表达水平明显降低，包括N-钙黏蛋白、MMP2、转录因子和人类直系同源物蛋白，从而抑制了结肠癌细胞的侵袭和转移。Hou 等[11]还发现参与调节细胞周期的蛋白质，包括p53、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白依赖激酶4、增殖细胞核抗原和NME1，在Caco2 阴性对照组和LHPP 过表达组之间差异有统计学意义（P <0.05）。而在靶向敲除LHPP 后，则出现相反的结果。更为重要的是，Li 等[19]发现紫红素可以在结肠癌HCT-116 细胞系中作为LHPP 的激动剂开放LHPP 的表达，通过LHPP 下调细胞周期蛋白D1、生长因子受体、NF-κB，从而上调Bax、半胱天冬酶3 和半胱天冬酶9 的表达，最终促进肿瘤细胞的凋亡，并具有较小的毒副作用，这预示着LHPP 作为治疗结直肠癌的新的靶点可能具有广阔的前景。

2.5 LHPP 与前列腺癌

虽然我国前列腺癌发病率低于西方国家，但近年来由于人口老龄化和预期寿命的延长，前列腺癌发病率呈增长趋势[46]。尽管最近的研究进一步提高了前列腺癌诊断的准确性和治疗的有效性，但前列腺癌患者的5 年生存率和长期预后仍然未达预期[47]。因此，目前需要研究前列腺癌新的分子机制，获取新的诊断或治疗靶点，以协助提高前列腺癌在临床诊疗中的长期生存率至关重要。Lin 等[48]发现LHPP 在前列腺癌组织中的表达明显低于周围正常组织，且与患者的淋巴结转移呈负相关，但与前列腺癌患者的格里森分级无明显相关性。通过使用小干扰RNA 靶向干扰22Rv1和PC-3 细胞株中的LHPP 表达后，E-钙黏蛋白明显下调，波形蛋白明显上调，肿瘤细胞的侵袭转移能力相较于对照组提高了约50%，表明LHPP 在前列腺癌中也可以通过调控肿瘤细胞的上皮间充质转化，抑制肿瘤的侵袭和转移。值得注意的是，Lin 等[48]还发现环状RNA DDX17 可开放LHPP 的表达，二者可协同抑制前列腺癌细胞的生长和转移。虽然LHPP 单独预测前列腺癌的预后及分级的准确性较差，但其与环状RNA DDX17 协同作为前列腺癌的预后指标时，准确性显著提高。Li 等[49]则报道过表达LHPP 后，DU-145和PC-3 细胞株的菌落形成率受到明显抑制，通过流式细胞术分析显示LHPP 的过度表达诱导DU-145和PC-3 细胞的凋亡。体内实验也证明，基因敲除LHPP 的小鼠，相较于对照组的小鼠，其肿瘤的生长和转移明显加快，生存期明显缩短。该研究还发现N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）RNA 结合蛋白2可通过读取m6A 修饰位点靶向介导LHPP mRNA 降解，促进Akt 的磷酸化，活化Akt 下游的一系列通路，引起前列腺癌细胞的上皮间充质转化，促进肿瘤的侵袭转移。目前关于LHPP 在前列腺中的作用机制集中在上皮间充质转化领域，而关于LHPP 在前列腺癌中是否参与细胞周期及肿瘤代谢等调控的研究尚未展开，笔者认为这可能是LHPP 在前列腺癌中值得探究的重点方向。总之，LHPP 可协同环状RNA DDX17 共同作为前列腺癌的预后和分级指标，并可作为前列腺癌治疗的潜在靶点。

2.6 LHPP 和其他肿瘤

除了与上述3 种肿瘤密切相关外，如前文所述，还有多项研究证实LHPP 还参与了其他多个系统肿瘤的发生发展。包括胰腺癌、膀胱癌、黑色素瘤等。这些研究发现LHPP 在上述肿瘤组织和细胞系中均呈低表达，并与肿瘤的分期和预后相关。尤其值得关注的是，在胰腺癌、结肠癌、甲状腺乳头状癌、膀胱癌等不同系统的肿瘤中，LHPP 的缺失通过抑制PTEN 的活性，从而活化PI3K/Akt 通路发挥一系列生物学作用。PTEN 是继P53 之后备受关注的抑癌基因，其失活必然导致PI3K/Akt 信号通路的活化，该通路可通过参与细胞周期调节、免疫逃逸、血管形成、细胞侵袭转移和肿瘤耐药等环节直接或间接促进肿瘤的发生[50-52]。LHPP 的缺失可通过上调NEM1 和NEM2，促进组氨酸残基的磷酸化，从而促进PI3K/Akt 通路的活化，促进肿瘤的生长、侵袭、耐药和转移。这为我们开发LHPP 相关抗肿瘤药物的研究提供了新思路，即联合使用PTEN 激动剂或使用Akt 磷酸化抑制类药物，也许可以扭转LHPP 缺失后肿瘤的生长转移。

此外，Yang 等[22]在非小细胞肺癌的研究中发现，长链非编码RNA（lncRNA GAS5）正是通过抑制LHPP 的表达，从而导致了非小细胞肺癌对顺铂的耐药。而Zhang 等[21]则开发了一种iDPP/LHPP 纳米复合物，通过体外和体内实验证明，该药物可显著抑制黑色素瘤生长，且无明显不良反应。这些发现充分证明了LHPP 可作为肿瘤治疗的潜在靶点。

3 展望

大量相关研究证实，LHPP 的缺失参与众多肿瘤的发生发展，也参与了部分肿瘤的复发转移，这表明LHPP 可能会作为一个新的肿瘤治疗的潜在靶点。但LHPP 是否可作为评估肿瘤患者早期筛查、术后复发及转移的独立预测指标，仍需要大量的研究予以证实。由于此前关于LHPP 的研究集中于神经系统及精神系统疾病，与肿瘤相关的研究尚不足，因此关于LHPP在肿瘤中的调控机制、作用机制尚不明确，LHPP 与肿瘤关系仍需要进一步揭示。目前，笔者认为主要有两种关于LHPP 的治疗策略:第一种策略是通过直接使用重组人LHPP 蛋白或者LHPP 激动剂，目前已经取得初步成果[46]；第二种策略是针对LHPP 缺失后活化的下游通路，重点是活化的Akt 信号通路，目前虽然已有MK2206（Akt 抑制剂）用于肺癌治疗的临床试验，但相关的研究支持和药物开发仍相对缺乏[52]。因此，这可能会是LHPP 在肿瘤治疗研究中的重点方向，相信在不断克服各种局限和弊端后，LHPP 在将来可能会成为肿瘤新的预后指标和新的治疗靶点。