高糖对骨髓间充质干细胞作用机制的研究进展

常俊杰 解强 刘亦冰 戴文昊 高俊,2* 张曦,2

1.南京中医药大学常州附属医院，江苏 常州 213003 2.张曦名中医工作室，江苏 常州 213003

糖尿病性骨质疏松症(diabetic osteoporosis，DOP)是一种继发于糖尿病的全身性的代谢性骨病。在高糖(high glucose，HG)环境下，无论是1型糖尿病还是2型糖尿病，骨形成与骨吸收的动态平衡均被打破，引起骨代谢紊乱。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多谱系分化及自我更新的潜能，因此成为研究骨质疏松症发病机制的重要靶点，也凭其来源广泛、免疫原性低等优势成为骨组织工程理想的种子细胞。本文综述HG对BMSCs的作用机制，有利于突破DOP干细胞疗法的局限性，挖掘潜能优势。

1 BMSCs与DOP的关系概述

在骨髓微环境中，BMSCs的增殖、凋亡、分化、迁移等参与了骨代谢这一复杂的生物学过程。在长期HG环境下，干细胞会发生代谢紊乱，具体表现为，提前老化甚至凋亡、增殖受损、迁移缓慢、分化及旁分泌功能障碍等[1]。BMSCs的功能改变与功能障碍是DOP病态骨代谢模式的根本原因[2]，因此，BMSCs的功能活性与DOP的发生发展密切相关。

目前，不论是糖尿病还是骨质疏松症，其治疗不仅仅局限于药物疗法，而更多扩展到细胞疗法。越来越多的研究[3]表明，BMSCs在二者治疗方面都发挥了巨大的潜力。有研究[4]发现，将BMSCs植入颅骨缺损大鼠模型中，不仅可以观察到新骨形成，同时碱性磷酸酶等成骨标志物的表达也有所升高。然而，许多研究证实，移植到糖尿病患者体内的BMSCs由于长期受到HG环境的“污染”，导致其出现衰老凋亡、增殖能力降低、成骨分化受损等一系列的不良表现，降低了其功能效应，甚至引发骨质疏松症，这无疑限制了BMSCs对DOP的治疗效益与应用价值。因此，深入研究HG对BMSCs的作用机制有利于为临床治疗DOP提供新思路。

2 HG对BMSCs的作用机制

2.1 HG影响BMSCs增殖

综合多个HG对BMSCs增殖影响的研究，我们发现，由于实验采用的细胞种属、细胞系、培养方式等的不同，结果不一。蒋孟佚[5]研究显示，长期HG会削减大鼠BMSCs的增殖。但Li等[6]证实，HG对人BMSCs与大鼠BMSCs增殖影响的结果相反，即HG会促进人BMSCs的增殖，其原因大概是，与鼠BMSCs相较，人BMSCs的干细胞特性更强，可以抵抗HG毒性。此外，赵同平等[7]研究认为，HG在短期内可以增强小鼠BMSCs增殖水平,但长期来看，HG又会抑制这种增殖效应。对于不同葡萄糖水平的定义，韦恩秀等[8]提出，处于细胞增殖峰值的葡萄糖水平为正糖，低或高于此水平则分别称之为低糖或HG，且在实验研究中，将小鼠BMSCs增殖活性最佳的22.5和50.0 mmol/L葡萄糖水平定为正糖，并发现，经22.5 mmol/L正糖预处理后，更换不同葡萄糖浓度再持续培养时，与正糖状态相比，100～300 mmol/L的短暂HG具有促增殖作用，即短暂HG可以提高小鼠BMSCs增殖水平，而且这种短暂HG促增殖作用只对正糖预处理成立，对低糖预处理或交替培养不成立，然而，无论是HG持续性培养还是HG间歇性培养，一旦时间延长，都会抑制BMSCs增殖。

2.2 HG促进BMSCs凋亡

细胞凋亡是在一系列凋亡信号诱导下引发细胞内级联反应从而导致细胞发生主动死亡。研究[9]表明，HG(55 mmol/L)可提高小鼠BMSCs凋亡率，长期HG会引起晚期糖基化终末产物积累，导致BMSCs凋亡。由于HG可以诱发氧化应激，程韶等[10]研究认为，大量活性氧能介导Wnt/β-catenin、Pl3K/AKT等信号通路，使BMSCs凋亡与衰老，进而使骨重建失衡。另有研究[11]表明，以HG高脂或炎性因子等来模拟糖尿病微环境能够引起BMSCs凋亡。

2.3 HG促进BMSCs自噬

自噬是真核细胞在应激状态下为维持内环境稳定，产生自噬溶酶体，降解自身内部受损细胞器、大分子蛋白质等，进而调节关键因子等的表达，以介导机体新陈代谢的一类机体损伤保护机制。Beclin1和LC3Ⅱ是自噬相关因子，其表达变化可以反映细胞自噬程度[12]。现代研究指出自噬与骨代谢疾病紧密相关，自噬介导的骨代谢失衡是多种骨病的根源。研究[13]发现，自噬可以通过Hedgehog、Wnt/β-catenin、AMPK/mTOR、BMPs/Smad、RANK/RANKL等信号通路调节2型糖尿病骨代谢。刘艳等[12]研究认为，HG会促进BMSCs中Beclin1和LC3Ⅱ的表达，使细胞产生更多的自噬体，表明HG环境可以增强BMSCs的自噬程度，揭示了BMSCs的自噬失衡可能与DOP相关。张平[14]也指出，在HG高胰岛素状态下，BMSCs会加速衰老，其自噬程度会得到加强。同时，HG状态下，BMSCs表现出早衰倾向，IL-6等衰老相关炎性细胞因子分泌增加，BMSCs可能是通过自噬介导的衰老来避免凋亡以保持细胞存活。此外，DOP的发生与细胞氧化应激水平密切相关，而线粒体是细胞氧化应激发生的主要场所。因此，线粒体功能受损对于BMSCs的成骨分化有一定的抑制作用[15]。线粒体自噬被认为是一种降解受损或老化的线粒体的特殊细胞存活机制[16]。近年来一些研究[17]发现，线粒体自噬和BMSCs的成骨分化密切相关，而且HG可能会抑制大鼠BMSCs在成骨分化过程中的线粒体自噬现象。

2.4 HG诱导BMSCs铁死亡

铁死亡是近年来发现的区别于细胞凋亡、自噬、坏死等的一种氧化性死亡方式，其特征表现为铁依赖性的细胞内脂质活性氧生成与降解失调[18]。有研究[19]指出，DOP与慢性铁蓄积导致的活性氧升高密切相关。张希等[20]研究认为，HG会引起BMSCs内的活性氧和脂质过氧化产物增加，且使BMSCs线粒体萎缩、膜密度增加、内膜嵴减少，从而使BMSCs发生铁死亡，抑制其成骨分化。现代研究关于其具体作用机制尚未完全阐明，但部分研究[21]指出，铁过载可以抑制BMSCs的Wnt信号，诱导铁死亡，从而抑制BMSCs成骨分化，过量的铁通过下调BMSCs中Runx2的表达来抑制其成骨分化[22]，铁过载诱导BMSCs产生活性氧，从而干扰了BMSCs成骨分化过程[23]。然而，在HG环境下，有关BMSCs铁代谢与骨代谢的相关性仍需进一步研究。

2.5 HG诱导BMSCs分化

来源于胚胎时期中胚层的BMSCs具有多向分化的潜能，可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞等多种类型。

2.5.1成脂-成骨分化：BMSCs成骨分化在骨形成、维持及骨重建中都具有着重要的作用。目前影响BMSCs成骨分化的信号通路包括RANKL/RANK/OPG、Wnt、MAPK、AGEs/RAGE、Smad、Notch等，炎症、氧化应激等状态也影响BMSCs的分化能力。目前普遍认为PPARγ(过氧化物酶体增值激活受体)、Runx2是影响BMSCs成骨和成脂分化的关键转录因子，Wnt/β-catenin是影响BMSCs成骨和成脂分化的关键信号通路[24]。然而迄今为止，由于细胞来源不同或细胞代谢需求等的原因，HG对BMSCs的成骨分化存在一些争议。Yamawaki等[25]认为在HG环境下BMSCs可以产生更多的骨钙素和钙沉积，另有一些研究发现，BMSCs的功能依赖于葡萄糖的摄取。然而，更多的研究[26-28]发现，HG可以通过调节miR-493-5p/ZEB2或GSK3β、Hedgehog、NF-κB信号通路抑制BMSCs成骨分化。此外，HG还会促进BMSCs成脂分化，导致脂肪在骨髓腔中积累，进而使骨质、骨强度下降[29]。HG通过促进BMSCs的脂滴形成及PPARγ等成脂分化标志基因的上调表达，而减缓钙结节形成，抑制Runx2等成骨分化标志基因的表达来干扰其向成骨分化[30]。

2.5.2成血管-成骨分化：骨组织是一种高度血管化的组织，在静息状态下，骨血流量可占心输出量的10 %～15 %[31]。骨内血管不仅可以提供营养支持、运送代谢产物，而且与骨形成密切相关，是保持骨组织结构完整性的关键因素。集中在生长板干骺端、骨内膜、骨膜下区域的H型血管可以介导血管生成和骨形成的偶联过程[32]。H型血管的丰富度是评价机体衰老和骨量多少的敏感指标[33]。研究[34]表明，年龄相关的H型血管减少与骨质疏松症的发生发展密切相关，受损的骨量可以通过促进H型血管的生成来得到改善。H型血管可以参与调控BMSCs的分化过程[35]，BMSCs可以通过促血管生成从而促进成骨。HG会抑制BMSCs向血管内皮细胞分化[36]，而且HG削弱BMSCs向血管内皮细胞分化的机制可能就是HG自身或受其干预的生长因子促进了BMSCs的凋亡，使BMSCs的增殖受损，从而使BMSCs成血管分化能力减弱。

2.6 HG影响BMSCs的定向迁移

BMSCs进入外周血循环时，在各种因子的相互作用下，可以附着在血管内皮细胞上，同时G蛋白偶联受体与其结合，经激活的BMSCs能够在骨受损区参与骨形成过程，在骨损伤的再生修复过程中，BMSCs的募集发挥了重要作用[37]。BMSCs向骨受损区的募集与其定向迁移能力密切相关，而且应用BMSCs治疗骨质疏松症时，需要其定向迁移至骨组织才能使治疗效益最大化。

趋化因子及其受体是调控BMSCs定向迁移的重要因素。基质细胞衍生因子-1(SDF-1)是一种趋化因子，与其G蛋白偶联受体CXCR-4相互作用可发挥细胞趋化功能。许多研究表明，SDF-1在骨受损区高度表达，BMSCs可以在SDF-1/CXCR-4通路的趋化作用下，定向迁移至骨受损区，从而发挥骨形成功能。然而，张博[38]发现，在HG环境下，CXCR-4的表达受抑制，从而影响SDF-1/CXCR-4通路对BMSCs定向迁移能力的调控。此外，HG会使BMSCs过早老化，分泌大量炎性因子，抑制BMSCs的定向迁移。唐雪[39]表明，模拟糖尿病的HG无血清状态，可使BMSCs的旁分泌因子减少，进而影响其迁移能力。这些研究都表明HG可以抑制BMSCs的定向迁移，限制BMSCs向骨受损区募集，进而影响骨代谢的过程。然而有学者[40]表示，HG可促进人BMSCs的迁移。

2.7 HG影响BMSCs的旁分泌功能

研究发现在外界微环境刺激下，BMSCs可以通过旁分泌多种生长因子促进骨修复和再生。这些生长因子包括胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1，TG-β1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等可以影响成骨细胞活性，从而使BMSCs参与骨重建与血管形成的耦合过程以修复骨缺损[41-42]。王广阔等[43]研究认为，BMSCs可以通过旁分泌作用使成骨相关基因Osterix、Runx2、OPN表达上调，从而提高成骨细胞成骨活性，也会使成骨细胞迁移相关基因MMP-2、MMP-9表达上调，从而促进成骨细胞趋化迁移到骨损伤部位，此外，BMSCs旁分泌作用还能增强成骨细胞增殖能力、成骨矿化能力。然而，在HG环境下，BMSCs的旁分泌作用被抑制[44-45]。

3 结语与展望

BMSCs的生物活性与功能特性与DOP的发生、发展及治疗均有着密不可分的联系。研究HG对BMSCs的影响作用，既可以深入了解DOP的发病机制，又可以为干细胞疗法发挥更优效益提供理论支持。综上所述，HG对BMSCs的作用存在双向性，一方面，在HG环境下，BMSCs会加速凋亡、铁死亡及成脂向分化，而减缓旁分泌及成血管向分化，进而抑制成骨；另一方面，HG通过促进BMSCs及线粒体自噬，保存细胞活性，一定程度上会促进成骨。在BMSCs增殖方面，HG对不同来源的细胞系有不同作用倾向，但一般认为，短暂HG会促进BMSCs增殖，持续HG会抑制BMSCs增殖。此外，HG对BMSCs定向迁移也有不同的作用倾向，但大部分研究表明，HG会抑制其定向迁移能力。

虽然越来越多的学者通过研究HG对BMSCs的影响来间接为DOP的治疗提供实验论据，但其具体机制还有待进一步明确。而且，基础与临床研究均证明，DOP患者的BMSCs并非单纯处于HG环境下，其铁、脂、激素、蛋白质水平均处于异常状态，因此，HG对BMSCs的影响与其它物质代谢之间又具有一定的联系，并且是交互影响的，存在着错综复杂的关系网络，故对DOP的理论认识仍需要日益更新。