细胞外囊泡作为一种新型肿瘤标志物在肝癌诊治中的研究进展

许京伦,孟子辉

(吉林大学中日联谊医院 肝胆胰脾外科，吉林 长春130033)

肝癌(HCC)是全球范围内非常常见的一种恶性肿瘤，其发病率及死亡率均较高，也是癌症死亡的最常见的原因之一，其发病率在消化系统的恶性疾病中排名第3位，仅略低于胃癌及食管癌[1]。HCC肿瘤生长及转移速度较快，预后较差，生存周期较短，且发现时往往为肿瘤晚期，每年大约有84万例肝癌新发患者，至少有78万人死于肝癌[2]。近年来，细胞外囊泡(EVs)在HCC的发展转移及诊断和治疗中的作用引起了广泛关注。EVs及其包裹的蛋白质、miRNAs和lncRNAs可为肝细胞癌提供新的诊断标志物，同时，EVs也是治疗肝细胞癌的潜在靶点[3]。EVs与癌症相关，包括癌症进展、血管新生、药物抵抗、免疫逃逸及肿瘤相关血栓的形成等[4-5]。本文综述了EVs的产生、分离方法及其在HCC的发展、转移及诊断与治疗中所扮演的角色。

1 EVs

1.1 EVs的产生

EVs由磷脂双分子层及各种囊内容物组成，是一种由细胞主动向外释放的膜性小囊泡，EV内容物组成包括与膜相关的功能蛋白和腔蛋白、脂质、代谢物和核酸，特别是mRNAs和microRNAs，它们是发挥旁分泌和系统作用的生理和病理信息的来源，它们被磷脂双分子层包裹，并保护它们不被降解，甚至可以将其传递到远离囊泡起始处的位置[6]。根据生物学特性或释放途径不同可将EV分为微囊泡(MV)、外泌体、内体和凋亡小体。MV直接从细胞膜释放，直径为100 nm～1 μm；外泌体直径为30～120 nm，由细胞内多泡体释放；内体主要由恶性组织细胞产生，直径为1～10 μm；凋亡小体直径为50 nm～2 μm，由凋亡细胞释放[7]。其中研究最全面、最常用于肿瘤治疗的是外泌体。

1.2 EVs的提取

诊断用EVs的来源不仅限于血液，还包括唾液、尿液、腹水、胸腔积液、支气管肺泡液，甚至呼气。EVs因体积小、密度低，很难将其进行高纯度高效率的分离，且其理化性质会根据不同的分离方法产生不一样的结果，因此，各种各样的分离方法会产生大量的不可控因素，故寻找一种分离纯度及分离效率较高，便于操作并廉价的分离方式是目前急需解决的难题。首先根据EVs的不同沉降特性从培养的肝癌细胞的培养上清液或血浆中分离它们，目前的分离方式主要包括：超速离心法[8]、密度梯度离心法[9]、尺寸排阻色谱法[10]、超滤法[11]、聚乙二醇沉淀法[12]、免疫磁珠分选法[13]。超速离心法是最常用的方法，可以在消耗较少试剂的情况下，从大量样品中分离出EVs，然而此方法分离的EVs纯度较低，操作简单，可用于大批量样本，缺点是所需器械非常昂贵，且分离时间较长，离心力过大，可能会影响到分离结果的完整性； 密度梯度超速离心法较超速离心法可以提高分离效率，缩短分离时间，并可提高分离的纯度的同时相对较好的保持EVs的活性，然而总耗费时间仍较长，并需要高度注意配制惰性梯度介质时需把握其渗透压，因此，前两种分离方法都存在的劣势，即昂贵且耗时耗力，临床应用有限。尺寸排阻色谱法相比较而言，高度保持了主要EVs的特点，包括泡状结构和内容，分离的EV纯度较高，这为将来的应用提供了保证，但需要特殊的仪器，得到的EVs样本量非常少，同样耗时耗力，因此也限制了其应用。超滤法简单高效，廉价且分离周期较短，但问题在于所分离得到的EVs数量较少，且纯度较低； 聚乙二醇沉淀法操作简便，省时省力，但纯度较低，且假阳性率高，其结果容易受到其他疏水蛋白质的影响。免疫磁珠分选法特异性好，纯度高，但同样受制于其特殊的设备和高昂的成本。近年来有研究提出将超滤法和超速离心法相结合的办法，可有效分离出EVs的不同亚群，应用前景可观[14]。

1.3 EVs的功能

EVs功能取决于其内容物组成包括与膜相关的蛋白、脂质、代谢物和核酸。细胞在不同的状态分泌的EVs内含物不同，每一个EVs都会携带特定的分子信息，包装的独特分子构成决定了要传递给受体细胞的细胞外信号的类型，而且由一个复杂的分选系统来决定那些分子能够进入细胞外囊泡。在不同的肝脏疾病中，这些囊泡的数量和内容物均可不同，且都能对细胞间的信息传递进行调控[7]。目前关于EVs形成、释放及EVs内成分被分选进入腔内囊泡的具体机制仍不清楚。有研究证明了来源于培养中的肿瘤的EVs和来自同一肿瘤患者血清的EVs具有相同的分子图谱[15]。EVs是细胞间信息传递的重要纽带，肝脏和其他组织分泌的EVs为临床诊断各种肝脏疾病提供了重要的生物标志物。免疫细胞分泌的EVs可以传递免疫相关信息，在机体抗肿瘤的过程中发挥重要作用。根据所含内容物、成熟状态、靶细胞类型的差异，免疫细胞分泌的 EVs 可通过激活或抑制相关免疫反应影响肿瘤进展，因此，充分利用其特点，有效对抗肿瘤。EVs的表面分子能够使其定位到靶细胞，与靶细胞结合后，EVs可以通过受体-配体相互作用发出信号，或通过内吞作用和(或)吞噬作用甚至是与靶细胞膜融合将其内容物递送至胞质液中改变受体细胞的生理状态。正因为这一特性，EVs可参与免疫反应和抗原递呈，对免疫系统的激活、肿瘤免疫逃逸，以及肿瘤的远端转移过程、血管生成、组织再生和神经变性疾病等都发挥着重要的作用。Muller等对脂质进行荧光标记后发现，EVs能通过脂质融合的方式进入靶细胞内，EVs的蛋白质和核酸可以被转运至目标细胞内，同时下游细胞的变化使EVs内在化。

2 EVs促进肝癌发展及转移的机制

肝细胞癌发生的原因是因为出现多个介导肿瘤行为、局部扩散和多灶性肿瘤发展信号通路失调,这些信号通路都可能被一种细胞间信号所调节，这种信号可以促进细胞信号和反应，使克隆增殖、非锚定生长和肿瘤扩散成为可能。细胞间信号转导的表观遗传调控可能是肝癌发生的重要机制[16]。研究发现，EVs在肝细胞癌的进展与转移中起重要作用，它可以通过影响肿瘤微环境，如促进细胞增殖[17]和上皮-间充质转化(EMT)[18]，增加血管生成中的管状形成和逃避免疫监视[19]的能力来介导癌症进展。

从不同来源的肝癌细胞(高转移MHCC97-H和低转移MHCC97-L细胞)中分离EVs，进行体外迁移和侵袭实验。结果表明，MHCC97-H衍生EVs预处理的MHCC97-L细胞的运动能力明显高于MHCC97-L-外泌体预处理[20]。肿瘤来源的EVs通过诱导效应T细胞的凋亡来促进肿瘤的进展及其免疫逃逸。肿瘤来源的EVs不同于树突状细胞(DC)或T细胞来源的EVs，它拥有独特的分子特征和免疫抑制功能，这有助于肿瘤逃避宿主免疫系统[15]。miRNA可调节许多细胞的发育过程，在癌症的发展和进展中起重要作用[21]，MiRNA是一种常见的非编码RNA，约有22ntRNAs，通过靶向调控mRNA的切割或翻译抑制从而参与多种生物学过程。转化生长因子 β 活化激酶 1(TAK1)是丝裂原活化蛋白激酶(MAP3K)家族的上游成员，可以维持肝脏细胞内稳态并抑制肿瘤的发生，HCC 细胞来源的 EVs 可通过其运载miRNA调节 TAK1的表达及相关信号，从而提高受体细胞的非依赖性增殖[16]。MCs释放的血管生成因子、基质金属蛋白酶(MMPs)和免疫抑制性细胞因子可为肿瘤提供支持性环境。有研究发现，在重现细胞间接触的条件下，癌细胞不但可以直接激活MCs，其驱动的EV还具有激活肿瘤周围MCs的可能性。

免疫细胞来源的EVs存在一种黏附受体整合素αMβ2，它可以调节免疫细胞的迁移，而这些EVs会被HCC细胞所摄取，从而增强HCC细胞的迁移、侵袭能力以及对内皮细胞的趋附性和远端转移能力[22]。

3 EVs在 HCC诊断中的作用

EVs以非均一膜性囊泡的结构广泛散在于各类体液中，可以成为一种无创的液体活检技术，其内容物受到其外层的膜的保护而拥有更高的稳定性，克服了其在体液中易被降解等特性。相对于组织病理检查，基于血清等样本的EVs检测具有无创、取样简便等优势，患者依从性更高。根据靶基因和表达水平的不同，miRNA既可能是肿瘤抑制基因，也可能是癌基因，既可能促进也可能抑制癌症的生长和进展。肝细胞或肿瘤细胞分泌的EVs可通过细胞外液进入血液循环，其携带的内容物信息可反应起初分泌时亲代细胞的状态，且这些内容物信息会随着亲代细胞分泌EVs时的状态和所处环境的改变而变化，EVs中的miRNA对核糖核酸酶具有抗性，所以它们在血液中是稳定的，因此EVs可以成为新的HCC诊断标志物[23]。

众所周知，HCC的发病与慢性肝炎及肝炎后肝硬化密切相关，慢性肝炎、肝硬化为肝癌的高危人群，此类人群检查肿瘤诊断标志物有助于早期发现HCC，对后续治疗能有极大的改善。慢性肝炎的炎性细胞因子IL-6和肿瘤坏死因子-α(INF-α)可以通过抑制miRNA-122的两种转录因子C/EBpα和HNF3β，并诱导c-myc介导的C/EBpα抑制，从而下调miRNA-122的表达，最终使miRNA-122在肝炎中的下调有助于肿瘤的发生[24]。因此，当循环血液中EVs所包裹的miRNA-122数量明显减少时，需高度警惕肝癌的发生。循环中的microRNAs miR-939、miR-595、miR-519d和miR-494可识别患有肝癌的肝硬变患者[25]。Zhou等人通过研究亚洲地区人口发现[26]，在区分患有和不患有肝癌的肝硬化患者的miRNA中，发现了循环中高水平的miR-595和miR-765，因此，循环miR-595和miR765作为与肝细胞癌相关的循环miRNAs有望区分有肝细胞癌和无肝细胞癌的肝硬化患者。Tomimaru等人发现[27]，无论是否存在肝硬变或慢性肝炎感染状态，肝细胞癌患者的miRNA-21循环水平较正常人都明显增加了，但其并没有进行在有无携带肿瘤的慢性肝炎或肝硬化的患者之间进行比较，因此其肝癌的诊断效果仍需进一步研究。Li等人提出，与正常人相比，肝癌患者的血清miRNA-221水平升高，且miRNA-221水平增高与肝硬化的存在有非常密切的联系[28]。长链非编码RNA(LncRNAs)作为一种内源竞争RNA(ceRNA)，可以通过竞争性结合miRNA来调节基因的表达，最终增加癌细胞的增殖与转移能力[29]。Baoguo Li等人的研究发现[30]，LncRNA FAL1在肝细胞癌组织中表达上调，并通过与miRNA-1236竞争性结合在肝细胞癌中发挥基因调节作用，促进肝细胞的增殖和转移。同时，LncRNA FAL1在肝癌患者血清EVs中也表达上调，因此，可以通过检测血清EVs中的LncRNA FAL1水平来推测是否有HCC的发生。

EVs还可作为预测肝癌患者生存及预后的标志物，Min Shi等人通过回顾性研究发现，血清EVs中miRNA-638水平较低的肝细胞癌患者的总体生存率低于miRNA-638水平较高的患者[31]，因此，可以认为血清EVs传递的miRNA-638可能成为一种可以预测HCC预后的循环诊断标志物。对抗肿瘤药物敏感的肿瘤细胞向耐药细胞转化可视作明显使预后变差的重要因素。多药耐药癌细胞可通过EVs将miR-32-5p传递给对药敏感细胞，并激活其PI3K/Akt通路，通过调节血管生成和EMT进一步诱导多药耐药[18]。LING-XIANG YU等人通过提取肝癌患者的快速迁移细胞及缓慢迁移细胞的EVs，使用miRNA测序分析鉴定出其中差异表达的miRNA，与慢迁移组相比，快迁移组中5个miRNAs(miR-140-3p、miR-30d-5p、miR-29b-3p、miR-130b-3p和miR-330-5p)下调，1个miRNA(miR-296-3p)上调，并且其中的MiR-30d、miR-140和miR-29b三个miRNAs与患者的生存时间明显相关[32]。原发肿瘤来源的EVs可通过SMAD3(SMAD 家族成员3)蛋白调节循环肿瘤细胞的黏附促进肝癌转移,并且肝癌患者外周血中含有丰富SMAD3蛋白的EVs[33]，这也提示着，外周血EVs中若含有大量的SMAD3蛋白可能代表着肿瘤有更高的转移能力。

4 EVs在HCC中的治疗作用

研究证实肝脏是静脉注射EVs后主要的摄取部位。免疫细胞来源的细胞外囊泡通过调节免疫系统来增强或抑制免疫活动，在抗肿瘤过程中发挥重要作用。将AFP基因修饰在DCs上，使得DCs表达AFP(DCAFP)，随后，收集DCAFP产生的外泌体DEXAFP。DEXAFP具有与DCs同等的免疫刺激能力，可以激活仅对表达AFP的肝癌细胞起作用的AFP特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。DEXAFP可诱导较强的抗原特异性免疫反应，显著抑制小鼠肝癌的生长，延长小鼠的生存寿命[34]。并提示增加miRNA-122可能是预防CHB患者肝细胞癌发展的有效策略。值得注意的是，用agomiR-122治疗阻断二乙基亚硝胺(DEN)-诱导的miR-122下调显著减缓了小鼠肝癌的发展[35]。Sheung-Fat Ko等人通过使用脂肪来源的间充质干细胞(ADMSCs)的EVs治疗患有HCC的小鼠(实验组)，并与未经治疗的HCC小鼠(对照组)比较肿瘤生长速度和生存寿命，发现对照组的肝细胞癌迅速增大，经过治疗10天后，实验组的肿瘤体积明显小于对照组，并且还发现外周血和瘤内自然杀伤T细胞(nNKT-cell)明显增多[36]，ADMSC来源的EVs可促进大鼠NKT细胞的抗肿瘤反应，从而促进肝癌抑制。Vps4A作为一种EVs生成的关键调节器，具有抑制HCC细胞生长、集落形成、迁移及侵袭的能力。Vps4A不但促进携带有致癌miRNA的EVs释放，而且在细胞中摄取并积聚抑癌miRNA。以上研究证实EVs转运miRNA是HCC细胞中miRNA特征性表达的重要自调机制，Vps4A可通过EVs调节miRNA在HCC细胞中的释放及摄取，从而实现抑癌作用。

5 小结

HCC作为一种高度恶性的肿瘤，全球范围内发病率都很高，且肿瘤发现时多数分期较晚，其预后往往极差，死亡率较高，而EVs虽然在肿瘤发生发展中起重要作用，但只要通过合理的应用，它也可以成为一种新发现的诊断与治疗手段，为肿瘤患者带来福音。目前已有研究提出许多种提取EVs的方法，近来也有人尝试将多种分离方式相结合的办法，但总体来说目前的分离方法仍存在价格高昂、条件苛刻、分离纯度较低和分离时间较长的缺陷，研究出方便廉价，分离效率、纯度高的分离方式是目前急需解决的难题。在HCC高危人群即慢性肝炎和肝硬化患者中，若检测EVs时发现其中某些核苷酸的改变，如miRNA-122水平降低，miRNA -939、miRNA -595、miRNA -519d、miRNA -494、miRNA-21、miRNA-221 和LncRNA FAL1水平升高，则需要高度注意是否有HCC的发生，或许能够早期发现HCC而改善患者的预后。同样，EVs在已确认肝癌患者中拥有着提示预后的作用，如血清EVs中miRNA-638水平较低的肝细胞癌患者生存寿命可能较短，快迁移肿瘤细胞中有5个miRNAs(miR-140-3p、miR-30d-5p、miR-29b-3p、miR-130b-3p和miR-330-5p)下调，因此可以猜想此类miRNA在外周血EVs中的低表达可能提示着肿瘤迁移速度较快，严重影响患者的预后，此外还有1个miRNA(miR-296-3p)在快迁移肿瘤细胞中上调，它在外周血EVs中的高表达或许同样提示着肿瘤有较强的迁移能力。肝癌患者外周血EVs中存在的丰富SMAD3蛋白，可以通过循环肿瘤细胞的黏附促进肝癌转移同样可以提示较差的预后。虽然有大量理论研究表明，EVs在治疗HCC中可能有较大的发展空间，但只是在小鼠实验中得到体现，目前并没有投入临床治疗观察中，尽管如此，它仍可以带给很多惊喜，为研究出新的肝癌治疗手段提供方向。然而，EVs并未进行临床的实际应用，其作为一种新型肿瘤标志物在肿瘤诊断与治疗中的应用仍需进一步的理论与实验研究观察。