革兰阴性菌的耐药特点及耐药机制研究进展

刘坚龄（天津市津南区疾病预防控制中心,天津 300350）

目前，临床上针对细菌的鉴别区分主要是通过革兰氏染色实现，即对细菌进行革兰氏染色，之后菌体呈紫色的即为“革兰氏阳性菌”，菌体呈伊红色的即为“革兰氏阴性菌”[1]。无论是哪类细菌均有杆菌及球菌，其中葡萄球菌、大肠杆菌以及绿脓杆菌属于临床最为常见的病原菌。其中革兰阴性菌是临床上分离率较高的一类病原菌，其检出率远远超过革兰阳性菌，且随着近年来抗生素以及免疫抑制剂等新治疗技术的广泛应用，在一定程度上促进了革兰阴性菌耐药菌株的出现，从而导致细菌耐药性的逐渐升高，最终促使细菌感染患者的临床治疗日益棘手[2]。相关研究报道显示，随着抗菌药物的大量应用，其所造成的细菌耐药性问题已成为当下医务人员所面临的重大挑战。随着国内外医务人员的不懈努力，大量的细菌耐药性相关研究层出不穷，为临床研究提供了相对丰富的细菌耐药性资料[3]。此外，有研究学者借助分子生物学技术实现了对细菌耐药机制的研究，继而促使多种新型耐药基因被发现，有利于细菌耐药研究资料的丰富，为细菌感染防治提供参考依据[4]。本文就革兰阴性菌对临床常见抗菌药物的耐药研究进展作一综述，旨在为临床治疗提供数据支持，现作以下报道。

1 革兰阴性菌的耐药特点

1.1 感染菌种分析 志贺氏菌以及沙门氏菌等致病性较强的菌种是既往导致感染发生的主要菌种，而当下以肠杆菌科（如大肠埃希菌以及克雷伯菌属等）以及非发酵菌群（如铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌等）为主，另有部分研究报道认为嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌等细菌是主要的感染菌种。总而言之，耐药革兰阴性菌的检出率正呈逐年攀升趋势，尤其是多重耐药菌株的检出率与日俱增，泛耐药菌株开始在多个地区出现。一项关于针对2000-2004年某医院住院及门诊患者的研究表明[5]：主要致病菌按照占比从高到低的顺序依次为大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、克雷伯菌属、不动杆菌属、肠杆菌属细菌，其中约有70%的致病菌属于革兰阴性菌。另有耐药相关的研究显示，各类革兰阴性菌均对抗菌药物存在一定的耐药性，且耐药率有逐年升高趋势。如2000年的亚胺培南耐药率为6.3%，时至2004年，其耐药率高达24.4%。耐药性最高当属氨苄西林，从2000年的85.1%升高至2004年的88.3%。第三代头孢菌素中的头孢他啶敏感性最高，从2000年的17.3%升高至2004年的32.4%，环丙沙星则由34.4%升高至48.0%，头孢哌酮钠舒巴坦钠及拉西林他唑巴坦耐药率分别从7.5%、18.5%升高至34.9%、30.1%。另有一项针对上海地区14所医院的临床分离株的耐药情况分析研究发现铜绿假单胞菌途虎鲍曼不动杆菌等的泛耐药株[6]。总而言之，革兰阴性菌的耐药问题不容乐观。

1.2 医院感染的背景 医院感染属于当下临床医学工作过程中亟待解决的重点以及难点，对患者的医疗质量产生极大程度的影响。尽管通过数十年的努力获得了一定的医院感染控制成果，但形势仍较为严峻。2001年、2003年及2005年的全国医院感染横断面调查结果发现，医院感染现患率分别为5.22%、4.81%、4.77%[7]。以泌尿系、胃肠道、呼吸道以及皮肤软组织等部位感染较为常见。医院感染的发生不仅会在极大程度上加重医务工作者的工作量，同时还会增加患者的治疗难度，增加患者及其家属的精神、经济负担。

1.3 致病菌的耐药情况 众所周知，不同的国家和地区、不同的医疗机构、同一医院的各个科室，不同菌种的耐药性均有所差异，且自同一患者相同标本中获取的同种菌株于干预前后耐药性亦会出现改变[8]。这充分说明了菌株来源和其耐药性存在密切关系。一项关于香港及北京两地不同医院的血液标本中的革兰阴性菌耐药性对比发现[9]，北京协和医院相关血液标本所有菌株对氨基糖甙类、β内酰胺类以及氟喹诺酮类抗菌药物的耐药性高出香港相同菌株的1倍；且北京相关医院的大肠埃希菌及克雷伯菌属的超广谱β内酰胺酶阳性率超过香港地区的2倍。另有关于县级医院和三级医院细菌耐药性监测的研究结果发现：MRSA、产ESBLs大肠埃希菌及产ESBLs肺炎克雷伯菌阳性率在县级医院中为5%、12%、15.18%，而在三级综合医院中为40.13%、20.1%、32.13%。另有一项关于中国CHINET细菌耐药研究表明：8所综合医院的22774株分离病原菌中革兰阴性菌占比66.9%，且ESBLs大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌检出率分别为20%-57%、13%-70%。

1.4 多重耐药或（和）泛耐药菌 此类菌种在各医疗机构内均存在多克隆散在或单克隆暴发流行。国内分子流行病学技术相关研究显示，医院存在不同程度的多重耐药菌株散发以及暴发流行的情况。尤其是于ICU、烧伤科以及呼吸科等科室接受诊治的老年患者存在较为严重的多重耐药菌株流行情况。

2 革兰阴性菌的耐药机制

固有/获得性耐药属于细菌耐药的两种类型，前者和细菌细胞壁成分以及药物作用机制有关。而后者的机制可能和下述几个方面有关[10]：①药物作用部位改变；②灭活酶产生；③主动外排机制；④细胞膜通道蛋白异常改变；⑤生物膜形成。

2.1 β内酰胺酶与革兰阴性菌耐药的关系 β内酰胺酶的产生是导致革兰阴性菌对β内酰胺类药物耐药的主要原因，其中不同地区、医院及科室的β内酰胺酶类型及其亚型分布不同。该菌种所产生的β内酰胺酶类型以涵盖广谱酶、超广谱酶、AmpC酶以及碳青霉烯酶为主。广谱酶主要亚型由TEM-1、TEM-22、SHV-1以及苯唑西林酶家族。该类酶可被或不被克拉维酸抑制[11]。超广谱酶主要涵盖TEM家族、SHV家族、PER家族、VEB家族、GES/IBC家族、CTX-M家族、OXA家族。该类酶底物是广谱酶底物、氧亚氨基头孢菌素、单酰胺类等。该类酶仅OXA家族亚型不被克拉维酸抑制。AmpC酶包括染色体/质粒介导的AmpC酶，前者主要存在于肠杆菌、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌以及枸橼酸杆菌等；后者按照来源可分作源自哈夫尼亚菌、摩根氏菌、弗劳地枸橼酸杆菌、龈沟肠杆菌以及未知来源的FOX、MOX共6个不同群[12-13]。该类酶底物是超广谱酶底物以及头霉素，不被克拉维酸抑制。碳青霉烯酶涵盖IMP家族、VIM家族、OXA型碳青霉烯酶等，其底物为超广谱酶底物、头霉素、碳青霉烯类。

2.2 氨基糖甙类修饰酶（AMEs）与革兰阴性菌的关系 AMEs产生是导致革兰阴性菌对氨基糖甙类药物敏感性较低的主要原因，同一修饰酶可对差异性底物发挥作用，且同一菌株可能携带多种修饰酶。临床上将AMEs按照酶功能的差异分作乙酰转移酶、肝转移酶以及磷酸转移酶3种。相关研究表明，革兰阴性菌的AMEs携带率为30%-95%，且有多种基因型，其中约有40%的耐药菌种携带≥2种AMEs基因[14]。

2.3 其他因素 革兰阴性菌对氟喹诺酮类产生耐药的重要机制涵盖下述几点：①氟喹诺酮类药物染色体靶酶基因的改变；②质粒参与的qnr基因出现；③主动外排机制；④DNA旋转酶gyrA基因突变以及拓扑异构酶Ⅳ parC基因突变。相关调查数据显示[15]，质粒参与的qnr基因总发生率为1.9%，包括肺炎克雷伯菌属、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、枸橼酸杆菌属以及沙门菌属。另有相关研究数据表明，质粒参与的qnrA、qnrB、qnrS总发生率分别为3.88%、6.20%、2.33%[16]。细菌携带差异性耐药基因会导致其对氟喹诺酮耐药水平不同。

2.4 多重耐药和细菌多种耐药机制的关系 多重耐药的革兰阴性菌可同时携带数种β内酰胺酶、氨基糖甙类修饰酶以及qnr基因，提示了该菌种的多重耐药可能是多因素共同作用的结果[17]。亦可将其看作细菌在抗生素影响下的“优胜劣汰，适者生存”结果。其中整合子更是在细菌获得多种耐药基因过程中扮演着至关重要的角色，多重耐药菌株的整合酶检出率超过97%。同类整合子往往携带多种耐药基因盒，而一种耐药基因又可出现多种整合子。由此推测，整合子可能参与了耐药基因于差异性菌株和菌群中的移动，在细菌多重耐药中起着极其重要的作用[18-19]。

2.5 粘菌素异质性耐药与革兰阴性菌的关系 截止到目前，已经发现的粘菌素异质性耐药的现象属于肠杆菌科细菌，尤其是以肺炎克雷伯菌以及阴沟肠杆菌为主。在此基础上，根据大量的文献也可以知道，在伤寒沙门菌以及大肠杆菌中，也存在一定程度的粘菌素异质性耐药的现象。科学人员通过大量的实验证明，在肺炎克雷伯菌的粘菌素异质性耐药的情况中，异质性耐药机制主要有两个方面，第一个是粘菌素耐药亚群中，有小菌落发生变异，导致其生物膜在形成的时候能力变强；第二个则是在粘菌素耐药亚群中，发现了粘菌素耐药相关的一些基因，正是因为这些突变基因的出现，导致其发生了变化。除此之外，科学人员通过大量的实验以及研究，还在阴沟肠杆菌中发现了同样的变化。阴沟肠杆菌的粘菌素异质性耐药机制与细菌和宿主中溶菌酶发生了耐药性。科学研究人员利用实验也证明了这一点，阴沟肠杆菌中可以通过突变的基因进入到其脂质中，通过这样的方式对脂质进行重新的修饰，这就是粘菌素异质性耐药出现的原因。在阴沟肠杆菌中也有一个突变的基因，通过编码蛋白质导致出现粘菌素异质性耐药。粘菌素异质性耐药在临床上的研究还不是特别的完善，还是需要在大量的动物实验中进行反复探究。

2.6 碳青霉烯异质性耐药与革兰阴性菌的关系 在肠杆菌科细菌中，碳青霉烯异质性耐药主要出现在肺炎克雷伯菌和大肠杆菌中，其中有些文献也通过实验发现，在阴沟肠杆菌以及产气肠杆菌中也出现了碳青霉烯异质性耐药情况。科学研究人员通过对国内外相关文献的研究和分析，在肺炎克雷伯菌的碳青霉烯异质性耐药中发现了一些酶。与此同时，科学研究人员通过大量的实验证明，正是由于一些基因发生了突变，导致其基因表达过量，使得其编码合成的蛋白质发生异常，进而在肺炎克雷伯菌中出现了碳青霉烯异质性耐药。但是大肠杆菌与肺炎克雷伯菌是存在一定差异的，其碳青霉烯异质性耐药是存在一定局限的，主要包括了流行性等方面和角度，这也给研究提供了另外一个角度。

3 结论

革兰阴性菌耐药性形势不容乐观，且耐药机制较为复杂，尤其是多重耐药菌株增加了抗菌药物治疗失败的几率，甚至会导致二重感染及死亡的风险有所升高。故此，如何有效降低革兰阴性菌耐药是广大医务人员亟待解决的难点、重点问题，值得临床重点关注。