肿瘤疫苗纳米佐剂的研究进展

张莉莉，向韡，刘超*，刘刚**

（1. 广西医科大学广西生物医药协同创新中心，广西组织器官修复医用生物材料工程技术研究中心，广西 南宁 530021；2. 厦门大学公共卫生学院, 分子影像暨转化医学研究中心,福建 厦门 361102）

免疫疗法是肿瘤治疗的重要策略，其作用方式是通过诱导机体特异性抗肿瘤免疫应答，或逆转肿瘤免疫抑制微环境以增强机体免疫系统对肿瘤的清除。在调节先天性免疫应答和诱导适应性免疫应答过程中，树突状细胞（dendritic cells，DCs）起着关键作用。DCs能够激活初始免疫应答及诱导免疫记忆，具有独特的摄取和处理抗原的能力，可将肿瘤抗原递送至引流淋巴结，并对抗原进行交叉呈递后激活细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），使其对表达相应抗原蛋白的肿瘤细胞发挥杀伤作用[1]。肿瘤疫苗正是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，以达到清除或控制肿瘤的目的。尽管在过去数十年中研发了各种类型肿瘤疫苗，但肿瘤抗原免疫原性弱造成的免疫耐受、临床试验应答率低等问题仍是当前面临的巨大挑战。

随着现代疫苗研发技术的成熟与进步，新型疫苗佐剂的发展为有效解决上述难题提供了新的策略。根据作用机制可将疫苗佐剂分为2大类：免疫原性增强剂形式与药物递送载体形式。纳米颗粒作为免疫原性增强剂刺激免疫系统引发免疫反应；或作为药物递送载体即抗原递送平台，将抗原与免疫刺激物转运至宿主免疫系统。随着纳米技术的发展，通过纳米药物递送系统将抗原与佐剂精准递送至免疫细胞已成为可能。这项技术有望加速肿瘤预防和治疗性疫苗的开发。研究表明，功能化纳米颗粒将抗原及佐剂靶向递送至淋巴结，可在不降低安全性的情况下提高疫苗效力[2]。这种作用效率的提高得益于纳米颗粒的表面积与体积的高比值，能够实现肿瘤抗原的高效装载，提供足量刺激抗原呈递细胞的抗原，进一步通过在纳米颗粒表面修饰抗体或其他靶向配体后可实现主动靶向特定的免疫细胞亚群，从而发挥更有效的抗原刺激效应。与游离抗原相比，纳米颗粒负载的抗原可引起更强劲的免疫反应[3]。结合纳米医学、结构生物学及免疫学前沿成果开发有效、安全，且易于生产的纳米载体疫苗是未来疫苗研发的最有前景的方向之一[4]。本文对近年来若干应用于肿瘤疫苗研究中的纳米佐剂进行综述，并对这些纳米佐剂在肿瘤疫苗中的应用前景进行展望，以期为促进纳米医学及肿瘤疫苗学的发展提供参考。

1 用于免疫调节的纳米佐剂

纳米技术不断的发展激发了肿瘤疫苗领域研究者将具有佐剂效应的材料制备成纳米疫苗的兴趣。功能化纳米佐剂一方面可以提高抗原呈递细胞对抗原的交叉呈递能力；另一方面可以利用其本身可促进激活免疫细胞的作用诱导高效的特异性免疫应答。抗原与纳米佐剂共同刺激免疫细胞，可最大限度地激活免疫应答。

铝佐剂是目前唯一获得美国食品和药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准作为人类疫苗的佐剂。铝佐剂可选择性增强体液免疫反应，但无法有效诱导细胞免疫反应。Dong等[5]将氨基酚功能化的α-Al2O3制备成纳米颗粒，可有效诱导自噬依赖性的抗原交叉呈递，在体内外诱导了显著的T细胞增殖。

Luo等[6]将一种合成的含有叔胺与线性或环侧链的聚合物纳米颗粒PC7A作为纳米佐剂，通过STING通路激活Ⅰ型干扰素刺激基因，具有强烈的免疫刺激作用。这种纳米佐剂与抗原混合后形成一种简单的纳米疫苗，可诱导强劲的细胞毒性T细胞应答，并在多种肿瘤模型动物实验中展现出显著的抗肿瘤效果。

多糖衍生物也被证明具有免疫活性。将其作为疫苗佐剂可以增强机体的天然免疫功能。多糖佐剂主要包括葡聚糖、甘露聚糖、壳聚糖及其衍生物等[7]。基于潜在的促炎特性，将壳聚糖制备纳米颗粒并在表面修饰甘露糖基团，通过包裹肿瘤细胞裂解物可靶向抗原呈递细胞，促进DCs对抗原摄取和呈递，对肿瘤具有良好的治疗及预防效果[8]。

Zhu等[9]报道了超微小金纳米颗粒（4.5 nm）可直接穿透细胞质激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎性小体，促进活性氧的产生及微管相关蛋白1轻链3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3）的降解，从而缓解LC3介导对NLRP3炎症小体的抑制。该研究展示了金纳米颗粒可以作为疫苗佐剂，显著增强特异性抗体的产生。

某些生物材料组成的纳米颗粒本身也可作为有效的免疫佐剂。类病毒颗粒（virus-like particles，VLPs）是病毒衍生的一种稳定结构，通过基因融合或化学/肽链结合使其与肿瘤特异性抗原结合。VLPs可构成强大而灵活的纳米平台。VLPs具有颗粒的性质，可经局部注射进入淋巴结被DCs有效吞噬，随后通过与内体通路相关的转运体进入主要组织相容性复合体Ⅰ类分子（major histocompatibility complex classⅠ，MHC-Ⅰ）信号通路，可使抗原被交叉呈递[10]。

Alam等[11]验证了靶向DCs的VLPs作为疫苗载体可诱导细胞免疫。结合了DCs特异性细胞黏附分子CD209的VLPs可诱导细胞因子的释放，促进DCs成熟和特异性免疫应答，为疫苗接种提供一种有效的策略。CD209与VLPs的免疫原性相结合可能会成为一种增强肿瘤预防性和治疗性的策略。

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2 用于药物递送的纳米佐剂

另一类纳米佐剂在疫苗中发挥着抗原或免疫制剂递送、缓释的功能。通过将生物材料或者无机、有机复合物制备成的各种类型纳米粒子可通过吸附、连接、包裹、穿插等方式将免疫刺激分子和相关抗原协同运送至目标组织器官与细胞。以下根据这类纳米佐剂的主要成分进行分类描述。

2.1 金属与无机物

多种金属与无机物通过静电、疏水作用吸附抗原，发挥抗原储存库效应。它们作为载体在疫苗领域的应用极具潜力。

碳易被合成各种形状的纳米结构，如纳米管、纳米棒、介孔球体等。此类纳米颗粒可通过多种机制进入各种类型的细胞。在过去的几十年，研究者对碳纳米颗粒用于药物递送进行了大量的研究。有研究将单壁碳纳米管作为抗原载体，通过偶联抗原肽后，与免疫佐剂Titer Max混合制备成疫苗，在免疫动物后产生了高滴度的特异性免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）应答[12]。随后有研究制备了氧化的多壁碳纳米管（multi-wall carbon nanotubes，MWCNTs）。氧化后的碳纳米管具有大量含氧基团，使其具有亲水特性，因而具有良好的分散性；氧化的MWCNTs可提供大量的附着位点，使抗原与佐剂以非共价键的方式吸附于管壁上，作为抗原库可使疫苗发挥持久作用，诱导强劲的CD4+及CD8+T细胞介导的免疫应答，接种疫苗后显著抑制了肿瘤的发展[13]。在另一项研究中，氧化石墨烯作为抗原的递送平台，也诱导了强烈的细胞免疫反应[14]。

基于磷酸钙合成的纳米材料因其生物相容性和生物降解性也被应用于肿瘤纳米疫苗研究领域。这种材料具有多孔性，可增加免疫刺激物的装载。磷酸钙在微酸性环境下溶解后不仅使得装载物得以释放，并且产生的Ca2+和 PO43-为无毒成分。磷酸钙这些特性使其作为纳米佐剂在递送免疫刺激物的应用方面具有强大的吸引力。有研究团队成功开发了一种基于甘露糖修饰的脂质磷酸钙纳米颗粒疫苗，通过调节肿瘤微环境增加了疫苗的抗肿瘤免疫反应，从而有效抑制了晚期肿瘤的生长[15]。

此外，利用阳离子物质修饰无机或者金属纳米颗粒，通过吸附作用负载DNA和siRNA等核酸结构，可实现在体内将核酸疫苗靶向递送至DCs，并诱导持久的抗肿瘤免疫应答[16-18]。基于金纳米颗粒极其稳定的结构基础，研究者可以对纳米颗粒的大小、形状和聚集状态进行调控。Zhang等[19]以阳离子型的金纳米颗粒作为核心，吸附阴离子型的免疫佐剂PolyIC制备新的纳米平台，精氨酸修饰的抗原经逐层沉积在金纳米颗粒的表面形成多层的聚电解质薄膜；通过调整沉积循环次数，可直接控制佐剂与抗原组合的比例和浓度。

无机物制备载体有易成型和结构稳定的独特优势。使用不同方式对其进行修饰时，它们特定的纳米形态不易被破坏，但其局限性在于大多需要进行表面官能团的修饰，或者包覆后才能将目标物搭载，需要添加大量的修饰物来增加装载率，故可能会增加疫苗制备的复杂性以及额外毒性。多项研究将无机物和有机物结合制备纳米复合材料，在免疫治疗上具有更优越的性能。由金属阳离子或团簇与有机桥接配体的配位形成的金属-有机骨架纳米颗粒（metal-organic frameworks，MOFs）是一种先进优良的载体材料，具有毒性低、包封效率高、合成条件适中等优点[20]。有研究基于MOFs的纳米颗粒制备原位肿瘤疫苗，用于光治疗后的抗肿瘤免疫治疗中，并展示了其在未来的临床转化潜力[21]。

2.2 高分子聚合物

高分子生物材料具有良好的生物相容性和生物降解性。目前基于聚乳酸-羟基乙酸（polylacticco-glycolic acid，PLGA）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）及其衍生物的高分子聚合物纳米递送系统被广泛研究与开发。高分子纳米微粒可通过亲水与疏水的作用制备或包覆多种药物，并实现药物缓释的作用。

PLGA是FDA批准的一种生物可降解聚合物，具有良好的成颗粒性能。多项研究将PLGA作为纳米核心负载药物，并广泛应用于药物控释产品的开发中[22]。有研究者利用PEG衍生物制备了AlO(OH)聚合物纳米颗粒，联合佐剂CPG可发挥显著的抗肿瘤作用[23]。

一些聚合物本身所具有的特定性能，或不同纳米形态特征也赋予了其在疫苗平台应用中的独特性。Xu等[24]利用胍基苯甲酸具有的在细胞质中递送蛋白及核酸的能力，将其作为蛋白抗原载体，以促使DCs对抗原进行有效的交叉呈递。通过联合CpG佐剂与程序性死亡受体1（programmed death-1，PD-1）抗体，胍基苯甲酸纳米疫苗平台显示出良好的抗肿瘤效果。

有研究者开发了一种可注射水凝胶，为肿瘤疫苗提供了有效的可持续释放平台。皮下注射后局部释放的纳米级多聚物可使抗原物质被DCs内化，并能有效控制免疫调节因子的释放，招募DCs的能力比传统的同类产品提高6倍[25]。

除纳米颗粒、水凝胶的形式，这些聚合物还可以制备成胶束、树枝状大分子的形式。聚合物胶束具有制备简单、易于修饰以及可同时装载多种药物的特点。在肿瘤疫苗应用中，由于其粒径较小，容易渗透至淋巴结内，有利于肿瘤抗原和免疫佐剂的递送。Jiang等[26]通过将抗原与两亲性聚组氨酸-聚乙二醇[poly(L-histidine)-poly(ethylene glycol)，PLH-PEG]偶联，创建了一种新的pH/氧化还原双敏感胶束肿瘤纳米疫苗（ovalbumin-loaded pH/redox dual-sensitive micellar vaccine，OLM-D）。OLM-D可以加速抗原从溶酶体逃逸，提高抗原交叉呈递，从而增强肿瘤疫苗的治疗效果，这对肿瘤纳米疫苗的设计具有指导意义[26]。

2.3 脂质载体与仿生膜囊泡

脂质体属于新型靶向给药系统，是一种具有类似生物膜结构和通透性的磷脂双分子囊泡。脂质体或改性的类脂质体作为靶向载体已成为近年来研究热点。它们的低毒性也推动了研究者利用脂质体作为疫苗载体的研究。目前已开展一系列针对脂质体肿瘤疫苗有效性与安全性的临床试验[27]。

有研究利用磷脂、高密度脂蛋白组装成纳米圆盘，可以将佐剂与抗原肽嵌入其中，制备了个性化肿瘤疫苗[28]。此外，一些单层脂质体经过聚合物修饰后可优化其性能。Yuba等[29]使用具有羧基基团的聚环氧丙醇衍生物修饰而形成pH响应的脂质体，促进了抗原的细胞质递送，并且可诱导DCs的MHCⅠ类分子介导的抗原呈递，促进细胞免疫应答。在该课题组近期研究中，通过纳入具有生物活性的多糖，使脂质体靶向抗原呈递细胞的表面受体，在免疫动物后引起了较强的抗原特异性免疫反应和抗肿瘤作用[30]。在过去的十几年里，有许多研究专注于使用聚电解质制备多层膜的囊泡，以优化单层脂质体囊泡封装能力，实现抗原与佐剂的共包封[19,31-34]。

外泌体是一种备受关注的源于质膜的胞外脂质囊泡，是内分泌系统的衍生物，在特定的细胞之间介导通信，也可以在免疫应答中发挥多样化的作用。有研究表明，单次注射来自成熟DCs携带抗原的外泌体可诱导效应T细胞应答[35]。从M1型巨噬细胞中获取的类外泌体纳米囊泡可以使M2TAMs重新极化为M1型巨噬细胞，可抑制肿瘤的增长，并增强免疫检查点抑制剂的治疗效果[36]。将外泌体作为疫苗开发的工具具有广阔前景，但仍然面临一些挑战，其中包括来自不同细胞衍生外泌体的表征及纯化技术有待进一步发展。

细胞膜作为天然的膜抗原载体，其衍生的人工囊泡在抗原递送中有着重要作用。Zhang等[37]通过基因工程技术将病毒抗原定向表达在细胞膜上，制备了拟病毒囊泡疫苗。肿瘤细胞膜含有大量的免疫原性抗原，肿瘤细胞膜用于制备纳米囊泡，可被用于激发特异性免疫反应。Yang等[38]用甘露糖修饰的PLGA纳米核心装载免疫调节剂，通过利用富含肿瘤特异性抗原的肿瘤细胞膜进行包裹，所制备的纳米疫苗增强了DCs等抗原呈递细胞的摄取，触发了强劲的抗肿瘤免疫反应。在另一项研究中，研究者在肿瘤细胞膜囊泡表面包裹一层PEG以增强膜纳米囊泡在血清中的稳定性，通过与αPD-1抗体的联合治疗，63%肿瘤动物模型得到治愈，且诱导了有效的保护性免疫[39]。Ye等[40]将肿瘤细胞膜纳米囊泡掺入含有免疫佐剂的热敏水凝胶中，包埋于皮肤组织，可持续刺激免疫反应，并减少外科手术后肿瘤向其他器官转移的风险。这或许提示了未来个体化肿瘤疫苗发展及在临床应用的一个方向。

3 用于联合治疗的纳米佐剂

单一疗法治疗后，肿瘤的转移和复发成为另一严峻的挑战。已有大量研究将基于各种生物材料的纳米颗粒作为免疫治疗的辅助工具，并将其发展为新型纳米制剂，与肿瘤局部治疗联合使用。在肿瘤联合治疗中，开发多功能纳米制剂来实现多种治疗药物的靶向、有效的递送，实现一体化的治疗成为趋势。

Yang等[41]报道了一种“多功能一体”的pH响应智能纳米囊泡，不仅可以作为联合治疗的纳米载体，还可通过凋亡前的钙网蛋白暴露导致免疫原性细胞死亡来激活宿主的免疫功能。多功能制剂可实现多种疗法的联合使用，引起级联免疫反应，显著提高治疗效果，是联合免疫治疗方案的一种优化。Xu等[42]开发了一种尺寸为80 nm、孔径为5 ~ 10 nm的可生物降解的二氧化硅纳米颗粒，可将CpG佐剂、光敏剂注入纳米颗粒内部，在表面通过二硫键偶联肿瘤新抗原，并携带放射性标记物后，将其作为联合免疫治疗的多功能纳米平台。通过正电子发射断层扫描成像技术引导光动力治疗和基于新抗原的肿瘤免疫治疗。在临床试验研究中，研究者观察到肿瘤消融治疗后肿瘤细胞碎片可引发抗肿瘤免疫效应，受到这些发现的启发，提出了一种联合光热治疗、佐剂和免疫检查点阻断的策略，在肿瘤热消融后通过使用能促进抗肿瘤免疫反应的制剂来抑制肿瘤的转移和复发[43]。有研究将一种以PLGA为核心表面引入多种基团的纳米颗粒，在放射治疗后，通过非共价和共价的相互作用捕获肿瘤抗原形成原位肿瘤疫苗，激活强劲的系统性抗肿瘤免疫反应，展示出显著的抗肿瘤效果[44]。

4 结语与展望

基于纳米佐剂的疫苗系统显示出强大的抗肿瘤活性，但纳米佐剂在临床应用转化过程中依旧面临诸多挑战。例如，纳米佐剂如何高效地将免疫刺激物转载递送至体内淋巴器官或淋巴细胞；局部注射是否能避免免疫刺激物发生全身播散后导致的毒性；纳米颗粒在体内对机体各个系统产生的安全性问题也有待解决。对于纳米佐剂与免疫细胞或器官的具体作用分子机制，佐剂与抗原剂量的关系，特定肿瘤类型与纳米佐剂类型间的选择，疫苗佐剂与治疗药剂的组合等复杂问题仍然需要更深入的研究。当前，纳米医学的发展为肿瘤疫苗的开发提供了许多新技术的参考，纳米佐剂以不同方式增强癌症免疫疗法。这些纳米佐剂可很大程度上增强装载物对免疫细胞与免疫器官的靶向递送。对于目前主要侧重于诱导适应性免疫的治疗方法，基于纳米佐剂合成的肿瘤纳米疫苗从策略上提供了巨大的实现可能性。鉴于纳米疫苗研发经验的积累以及免疫治疗临床成功案例在不断地增加，可以预见的是，新一代具有突破性的肿瘤疫苗已经不再遥远。