二维色谱技术在食品检测行业中的应用研究进展

◎ 晏弥卉，张建喜，侯国枝

（浙江创新生物有限公司，浙江 绍兴 312366）

随着国民经济的不断发展和人们生活水平的逐步提高，人们对食品安全提出了更高的要求与期望，食品行业的质量控制和监管也需要与时俱进地发展，这些都对食品检测行业带来了巨大的挑战。食品是一个复杂的样品体系，营养成分种类繁多，其中的物质含量水平差异巨大且基质干扰因素多，食品检测的分析方法往往也十分复杂和烦琐。色谱技术是现代检测中最普遍、最通用的分析方法，但在复杂样品体系的定性和定量过程中，传统的一维色谱法遇到了瓶颈，存在峰容量不足、分离效果差、微量成分受到常量成分干扰严重、峰重叠现象突出等问题。改善方法就是提高色谱分离系统的峰容量，然而单纯依靠提高色谱柱的柱效或增加色谱柱的选择性难以达到满意的分析要求，解决的最佳办法就是采用多维色谱技术。多维色谱技术自20世纪60年代发展起来，近年来已经发展得日渐成熟，因其具有高峰容量、高灵敏度、瓦片效应和族分离等特点，可以实现复杂样品体系的分析检测需求[1-2]。近些年来，多维色谱技术在环境检测、药物分析、石油化工、生物医疗和食品安全等多个领域展示了良好的应用前景[3-8]。

多维色谱可以是由同一种色谱分离技术的多根不同色谱柱的组合，也可以是由多个不同色谱分离技术的组合。多维色谱技术中由于硬件、软件和商业化等的限制问题，目前应用最多和最普遍的是二维色谱技术。二维色谱法是在一维色谱法的基础上将分离基质不同且相互独立的两根色谱柱串联起来组成的分离系统，其主要分离过程是样品先经过第一维的色谱柱进，再通过浓缩、捕集或进行切割后切换至第二维的色谱柱进行分离，使得在第一维色谱中不能完全分离或分离较差的组分可以在第二维色谱中实现更好的分离。

1 二维色谱的原理及分类

二维色谱技术主要分为两种模式，包括传统二维色谱技术和全二维色谱技术。传统二维色谱技术的原理是将两根不同极性的色谱柱组合起来，将第一维色谱柱中无法分离的部分组分，转入第二维色谱柱进行再次分离。传统的二维色谱的最大峰容量为N+N，常用C+C表示。全二维色谱技术的原理是将第一维中所有组分全部都转移到第二维中进行再次分析，这样使得样品中的每一个组分都接受了两种不同模式的分离。全二维色谱的最大峰容量为N×N，常用C×C表示。因此，全二维色谱的峰容量比传统二维色谱有了极大的提高，更加适用于复杂样品的分析[3]。

二维色谱技术包括二维液相色谱、二维气相色谱、二维离子色谱等，另外，还有一些新的二维色谱技术也在不断开发完善中[4-7]。二维色谱技术也可以与各种类型的检测器进行联用，如荧光检测器、电化学检测器、高分辨质谱检测器等[8]。特别是二维色谱与质谱技术的联用，结合了二维色谱峰容量大、选择性多和质谱特异性好、灵敏度高的双重优势，对于复杂混合物的分离和鉴定，展示出了强大的分析能力。相信其随着联用技术的进一步发展，可以为更多的领域提供广阔的应用前景和发展方向。

1.1 二维液相色谱

二维液相色谱主要分为离线模式（off-line）和在线模式（on-line），离线模式是指第一维色谱中的洗脱组分经收集后依次进入第二维色谱中进行优化分离[2]。在线模式是指第一维色谱中的所有或部分组分直接切入二维色谱系统中，进行再次分离分析。在线模式是目前主流的二维液相色谱技术，根据第一维的组分是否全部切入第二维色谱系统，又可将在线二维液相色谱分为中心切割模式（LC+LC）和全二维模式（LC×LC）[9-11]。中心切割模式是将一维色谱中部分组分切入第二维色谱中进行分析，而全二维模式是将一维系统中所有洗脱成分，按照一定的规则或间隔全部切入第二维分离系统中，该模式下可得到最多的样品组分信息，更适合于复杂样品或未知组分的分析[12-13]。

1.2 二维气相色谱

二维气相色谱分为中心切割二维气相色谱和全二维气相色谱（GC×GC），其原理主要是利用双柱系统，在满足各物质分辨率的前提下，获得更大的峰容量。中心切割二维气相色谱是应用较早且普及度高的一种二维气相色谱模式，利用双柱切换装置（多通阀、压力控制阀等）实现对单一或特定组分的检测。全二维气相色谱以其具有的分辨率高和峰容量大等优势成为近20年来应用和研究最多的二维气相色谱技术，工作方式是将两根相互独立的色谱柱以串联的方式连接在一起，色谱柱之间装有能起到捕集、聚焦、再传送作用的调制器，样品经一维色谱柱分离的全部峰通过调制器以周期性脉冲的方式进入第二维色谱柱进行再次分离，大大提高了峰容量。全二维气相色谱可以有效解决一维气相色谱共洗脱和峰容量不足的问题，为复杂组分的分析提供了新方法[14-15]。

1.3 二维离子色谱

离子色谱是分析离子型化合物的首选方法，但由于离子色谱的抗压性小、柱容量小、溶剂相容性差等原因，制约了二维离子色谱的应用，现在的二维离子色谱系统是基于阀切换/柱切换技术发展起来的[16]。阀切换技术分为3个部分，包括进样模块、分离模块和富集模块。进样模块是将待分析组分注入定量环中；富集模块是用于待测组分的富集和浓缩；分离模块使富集浓缩的待分析组分进行后续的分离测定。阀切换技术通常需要用到2个以上的阀，各阀之间的切换时间需要精准控制，否则会造成样品组分的流失。阀切换技术可以在线消除基体干扰、在线富集痕量物质，并且可以进行检测手段的联用。

2 二维色谱技术在食品检测行业的应用

在食品检测行业中，由于种类繁多且基质复杂，因此需要特异性强、灵敏度高、重现性好的分析方法。运用二维色谱技术不仅可以减少复杂样品中基质干扰严重的困境，而且对于痕量物质还能起到富集或浓缩的作用，因此二维色谱以其独特的优势正在成为色谱技术发展的一种新趋势，并且为食品检测行业提供了新的检测手段和研究方向。

2.1 二维液相色谱的应用

二维液相色谱法以其良好的正交性、更高的峰容量、较高的分辨率和高通量等特点，可用于食品中多组分的解析、物质表征、活性成分筛选或毒性物质筛查等。张艳海等[17]建立了在线二维液相色谱同时快速测定婴幼儿配方乳品和成人强化乳品中维生素A、维生素D3和维生素E含量的方法，方法选择C8柱和极性嵌合的反相C18柱构成的正交体系，在一维中完成维生素A、维生素E的定量测定和维生素D3的净化，二维中进行维生素D3的定量分析。样品经过皂化、萃取后可直接进样检测，一次进样即可完成乳品中维生素A、维生素D3和维生素E的定量，大大提高了分析检测的效率。赵玉富等[18]利用双泵双检测器搭建了在线二维液相色谱分离系统，建立了维生素A、维生素E、维生素D2、维生素D3和β-胡萝卜素含量的快速分析方法，5种维生素的加标回收率在90%～98%，方法的准确度高，方法的重现性好，分析检测时间短，25 min即可完成5种脂溶性维生素的分离测定，为乳制品中维生素含量的测定提供了参考。叶佳明[19]等利用SPE小柱在线富集原理搭建了一个在线固相萃取-二维液相色谱检测平台，使用该方法后样品经过皂化定容后可直接进样分析，重现性好，回收率高，并通过配对t检验法与标准方法（GB 5009.82—2016中第三法）测定结果进行比较，结果无显著性差异，适用于配方奶粉、米粉中维生素D含量的测定。张雯[20]等建立了一种检测发酵食品中苯乳酸的二维液相方法，测定了5种常见发酵食品中苯乳酸的含量，该测定方法的前处理简单，加标回收率在91.79%～107.37%，结果准确，抗干扰能力强，适用于大批量样品的检测。

2.2 二维气相色谱的应用

食品中含有大量挥发性物质，这些挥发性成分直接影响着食品的品质优劣、风味好坏，以及食品的营养结构，也是食品检测领域中的研究重点。二维气相色谱在白酒成分鉴定、香精香料、食物挥发物的测定等方面具有重要的优势。ROBINSON等[21]采用顶空固相微萃取技术建立的全二维气相色谱-飞行时间质谱联用法可应用于葡萄酒中挥发性物质的组分测定，同时分析了包括单萜类、去甲肾上腺素类、倍半萜类和烷基-甲氧基吡嗪类在内的350余种不同的挥发性或半挥发性化合物，可以用来评估葡萄酒中挥发性成分的差异。林凯等[22]利用固相微萃取-全二维气相-质谱法测定了井岗蜜柚、沙田柚和琯溪蜜柚3个品种中柚肉和柚皮的挥发性物质，共鉴定到233中挥发性物质，主要为萜烯类、烯醇类和醇类化合物，为柚风味相关深加工和提高柚产品附加值提供参考。李伟丽[23]等采用柱前衍生化全二维气相色谱-飞行时间质谱法对郫县豆瓣酱的复杂风味进行分析，共检测到987个化合物，并定性鉴别出有机酸类等10类共218个成分，为郫县豆瓣酱的风味解析、工艺优化及质量标准的提升提供了科学依据。

2.3 二维离子色谱的应用

离子色谱是一种通用性的、选择性好的检测方法，可用于痕量甚至超痕量物质的分析。二维离子色谱不仅克服了一维色谱分辨率低的缺点，而且简化了操作，节约了检测时间和成本。刘颖慧[24]等建立了一种阴离子交换色谱耦合脉冲安培检测器的二维离子色谱法，可用于测定海带中游离氨基酸的测定。该方法的前处理简单，无基底干扰，在最佳分离条件下20种氨基酸的线性关系好，线性相关系数r2＞0.99，方法的检出限低至0.01 mg·L-1，精密度高、准确性好。于曰雪等[16]采用一个切换阀和阳离子交换柱CRC建立了二维离子色谱法，同时测定了啤酒样品中的20种氨基酸和7种糖醇。该方法通过捕集切换手段对氨基酸进行捕集，再利用十通切换阀进行转换，使得氨基酸和糖醇可以进入两个并联的电化学检测器进行检测，达到同时测定啤酒中氨基酸和糖醇含量的目的。该方法样品的前处理简单，避免了氨基酸和糖醇的共洗脱，结果准确有效，可用于实际啤酒样品的分析检测。

2.4 其他二维色谱技术（薄层色谱、超临界流体）的应用

有一些新型的二维色谱技术如二维毛细管电泳色谱[4]、二维薄层色谱[5-6]、二维超临界流体色谱[7]等也在不断发展，为食品检测行业提供了更多的方向和可能性。二维薄层色谱在保留一维色谱所有的优点的基础上，大大扩充了峰容量，提高了分离效率。康燕等[25]构建了一种二维薄层色谱-表面增强拉曼散射联用技术，可用于饮料和水果中糖精钠的快速分析，采用纳米金修饰的二氧化硅微球作为增强拉曼散射的基底，提高了薄层色谱的分离能力，且提高了灵敏度。超临界流体二维色谱是用超临界流体色谱可代替正相色谱的特性，解决一些色谱系统中溶剂不兼容的问题。郭彦丽等[26]利用二氧化碳流体对正反向溶剂均有很好的兼容性的特点，构建了一套稳定的由二维三柱切换为基础的超临界流体色谱反相液质二维色谱系统，实现了对油脂类的在线净化和反向分离，实现了对油脂类样品的快速和自动化分析。

3 技术难点与关注问题

虽然二维色谱技术在食品检测中有了很多开创性的研究应用，但在实际推广过程中仍有诸多限制因素。①二维色谱技术仪器设备的价格普遍较高，使用和维护成本昂贵，且各种联用平台的搭建多为专业定制类，商业化程度低。②样品中各组分经二维色谱分析后，会产生大量的待分析数据，因此需要功能强大且复杂的数据处理系统，同时数据也需要经过专业的统计学处理分析，从而加大了二维色谱数据处理的工作量和分析难度。③目前适用于食品检测的各种通用方法或法定标准中几乎还未收载任何二维色谱的方法，相应的方法学验证指标也仅是借用一维色谱的方法学标准，在实际应用过程中还存在诸多困难。目前，二维色谱技术在食品检测行业的应用多处于研究阶段，还需要更多的关注和更深入的研究，才能发展成为一种成熟的检测模式以应用到大规模的实际检测工作中。

4 结语

二维色谱技术具有峰容量大和选择性高等优点，在食品检测行业中，拥有检测方便快速、节约成本等优势。相信随着二维液相色谱技术理论的逐步发展、硬件系统和软件控制的商业化模式的推出以及在多领域多行业应用研究的不断深入，二维色谱技术将会成为未来色谱技术发展的新机遇和新方向。