一例类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的诊断及防控

崔志刚，于合宅

（1.望都县农业农村局，河北 保定 072450；2.望都县畜牧站，河北 保定 072450）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）在我国猪场十分常见，该病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染所导致的一种传染病，又称为蓝耳病[1]。PRRS在临床上主要表现为仔猪呼吸道疾病（发病率和死亡率均较高）和妊娠母猪繁殖障碍（流产、死胎等），该病的流行给我国养猪业造成了巨大的经济损失[2]。

PRRSV属于单股正链RNA病毒，其基因组大小约15 kb，含有至少10个开放阅读框[3]。该病毒基因组部分序列在进化过程中容易发生突变，根据其基因组序列差异，可将全世界流行的PRRSV毒株分为2个基因型，分别为欧洲型和美洲型[4]。2008年美国学者分离到Nsp2基因序列存在131个不连续氨基酸缺失的毒株（命名为NADC30株），随后2012年我国出现与NADC30毒株基因组相似的PRRSV变异毒株（命名为类NADC30株），且当前该毒株在我国大部分地区猪场广泛流行[5-6]。尽管如此，当前我国流行的PRRSV基因型十分复杂，部分地区同时存在高致病性PRRSV毒株、类NADC30毒株和经典型毒株流行[1，7]。当前我国流行的3种PRRSV毒株的致病性存在差异，因此需要借助实验室诊断技术确定猪场流行PRRSV毒株的基因型，其将有利于疫苗的选择和其它防控措施的实施。2021年12月初，河北望都县某规模化猪场暴发疑似PRRS疫情，为确定病因，笔者对病猪进行剖检，取肺脏和淋巴结等组织样品进行实验室诊断，以期对该病的防控提供参考。

1 发病猪场情况

2021年12月初，河北望都县某规模化猪场暴发疑似PRRS疫情。据了解，该场繁殖母猪流产率达12%，仔猪或保育猪因呼吸困难、高热等病死率达40%左右。应猪场负责人的邀请，笔者进入该场发病栏舍，发现发病猪群主要集中于仔猪、保育猪和妊娠母猪。其中妊娠母猪出现流产（图1）；保育猪和仔猪出现高热、呼吸困难、耳尖及臀部皮肤有红色斑块（图2）；将病死保育猪剖检可见明显间质性肺炎（图3），且全身淋巴结肿大、出血等。根据病猪临床症状及剖检病理变化，可将该病初步判定为PRRS。为进一步对病因进行确诊，无菌采集2头病猪肺脏、淋巴结和扁桃体等组织样品，低温送至实验室进一步进行病原诊断。

图1 妊娠母猪流产

图2 保育猪呼吸困难、扎堆等

图3 间质性肺炎

2 实验室诊断

2.1 常见病原检测

使用灭菌手术刀切去少量肺脏、淋巴结和扁桃体组织样品共约2 g，切碎后移至研钵内，加入少量生理盐水，充分研磨后反复冻融3次。其后吸取上清液，高速（12 000 r/min）低温（4 ℃）离心5 min，取上清液用于基因组提取。使用DNA/RNA基因组提取试剂盒提取组织上清液基因组，操作步骤和注意事项参考试剂盒说明书，将最后获得的基因组保存于-80 ℃；取10 μL基因组使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，其后将cDNA保存于-20 ℃，备用。

以获得cDNA或DNA基因组为模板，使用商业化荧光定量PCR检测试剂盒分别对常见RNA病毒（猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、乙脑病毒）和DNA病毒（猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒）进行检测。每次检测均设置阴性对照和阳性对照，其中阴性对照为无RNA酶水，阳性对照为各检测体系对应病毒核酸，依据最终样品对应CT值判断检测样品对应病毒的阴性或阳性，其中CT值≤35则为阳性，CT值＞35或无CT值则判定为阴性。结果发现2份样品均为PRRSV核酸阳性，但其它检测病原均为阴性。

2.2 细菌性病原检测

将部分上清液通过平板划线法接种于鲜血琼脂固体培养基，其后将固体培养基分别置于37 ℃恒温箱和厌氧环境下37 ℃恒温箱内，培养16～24 h后观察培养基表面是否出现疑似菌落。若有，则蘸取少量菌落进行革兰氏染色，根据细菌大小、形态和颜色等对其进行形态学鉴定。结果发现，两种环境下培养基表面均未出现疑似菌落，提示该猪场未出现细菌性疾病。

2.3 PRRSV ORF5基因序列扩增及分析

为进一步确定该场PRRSV流行株的基因型，应用RT-PCR法对该毒株ORF5基因序列进行扩增与分析。其引物序列为：PRRSV-ORF5-F：5'-CCTGAGACCATGAGGTGGGG-3'，PRRSVORF5-R：5'-TTTGGGCATATATCATCACTGG-3'，引物委托郑州擎科智美生物科技有限公司合成。RT-PCR反应体系（50 µL）包括2×PCR mix 25 µL、上下游引物各2.0 µL、cDNA模板3.0 µL及无核酸污染水18.0 µL，每次反应均设置阳性和阴性对照，其模板分别为已知PRRSV基因组和无核酸污染水。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共35个循环；72 ℃ 7 min。反应结束后取5.0 µL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并将阳性产物送至测序公司测序，并对测序结果进行分析。

结果如图4所示，2份样品均成功扩增出PRRSV ORF5基因片段，凝胶电泳结果显示，2个毒株ORF5基因序列大小约530 bp，且阴性和阳性对照均成立。进一步测序结果表明，2个毒株ORF5基因序列大小为564 bp，核苷酸序列同源性分析结果发现从该场获得的2个PRRSV毒株ORF5基因同源性为99.8%，与PRRSV疫苗株（如MLV）ORF5基因序列同源性为82.8%～82.9%，与高致病性PRRSV毒株（如JXA1）同源性为85.6%～85.7%，与经典型PRRSV毒株（如FJFS）同源性为83.7%～84.0%。与GenBank收录的NADC30毒株同源性相对较高，为93.4%～94.6%，与国内流行的类NADC30毒株（如CHSD）同源性最高，为98.4%～98.5%。

图4 PRRSV毒株ORF5基因序列RT-PCR扩增产物凝胶电泳结果

3 诊断结果

根据病猪临床症状、病理变化和实验室诊断结果，可判定该场发病是由PRRSV感染所引起，且该PRRSV毒株与国内流行的类NADC30毒株同源性最高。

4 防控措施

使用PRRSV疫苗对该场不同发育阶段猪群进行紧急免疫接种。其中对经产母猪、后备母猪和公猪紧急免疫接种PRRSV灭活疫苗4 mL，2周后对以上猪群再次接种疫苗2 mL，其后每3个月免疫接种疫苗1次，每次2 mL；对15日龄哺乳仔猪免疫接种1次（1 mL）；对断奶保育猪免疫接种1次（2 mL）。

使用阿莫西林和替米考星等药物对不同发育阶段猪群进行药物治疗，以防止猪群继发感染：在饲粮中添加20%替米考星（2 kg/t）、10%阿莫西林（2 kg/t）和电解质多维（2 kg/t）对经产母猪、后备母猪和公猪进行饲喂，连续用药7 d；在饲粮中添加25%万乐霉素（800 g/t）、10%强力霉素（1 kg/t）和电解质多维（1 kg/t），给保育猪进行饲喂，自由采食，连用7 d。

提高饲养管理水平，如提高猪场消毒频率、实行带猪消毒，对粪污及时清除；在猪场内持续开展灭鼠等活动；持续对猪场PRRSV流行情况和抗体水平进行监测。

开展以上防控措施2周后进行回访，负责人反馈该场PRRS疫情已基本有效控制。基本未发现繁殖母猪流产和死胎等现象，少数仔猪存在呼吸困难和高热，但临床症状不严重，病死率相对较低。

5 讨论

近年来，PRRS的流行仍然对我国养猪业健康发展造成巨大威胁。该病原感染生猪可导致母猪流产、断奶仔猪呼吸困难、高热等，同时PRRSV感染可导致病猪出现严重的免疫抑制，容易出现继发感染其它病原。由于PRRSV在我国广泛流行，且该病毒基因组在进化过程中易突变，导致当前我国流行的PRRSV毒株基因型十分复杂，甚至部分地区同时流行多种基因型PRRSV毒株，但类NADC30毒株所占比例较高[1]。不同基因型PRRSV毒株对病猪的致病性存在差异，同时疫苗对不同基因型的防控效果也存在差异，因此我们需要确定发病猪场流行的PRRSV毒株基因型，这样有利于疫苗的选择和相关防控措施的制定和实施。

诚然，根据发病猪群临床症状及病理变化可初步判定为PRRSV感染，但仅通过临床诊断无法确定该场流行的PRRSV基因型，同时也无法确定发病猪群是否混合感染其它病原。为确定发病原因，我们对获得样品进行实验室诊断，初步诊断结果表明该场发病由PRRSV单一感染引起。进一步对该毒株ORF5基因序列进行扩增与测序发现，该毒株属于类NADC30毒株，且与国内流行的类NADC30 PRRSV山东株同源性相对最高，提示该场发生疫情可能是由于引种不当或生物安全水平较差导致PRRSV毒株进入猪场。

已有文献表明，当前PRRSV灭活疫苗对PRRSV类NADC30株具有很好的防治效果[8]，但对于PRRSV的防控不能仅依赖于疫苗紧急免疫。为此，我们建议猪场对不同发育阶段猪群进行紧急免疫的同时，还需要在饲料中添加抗生素（如阿莫西林和替米考星等）饲喂猪群，以防止猪群出现继发感染。结果也证实实施以上措施后，对类NADC30 PRRSV具有很好的防治效果。