兼抗白叶枯病和细条病水稻材料的创新及育种利用

罗同平，黄春东，张月雄，秦媛媛，岑贞陆，刘 驰，韦敏益，秦 钢，马增凤，黄大辉

(1.广西农业科学院水稻研究所/广西水稻遗传育种重点实验室/国家水稻改良中心南宁分中心，南宁 530007；2.玉林市农业科学院/广西农业科学院桂东南分院，广西 玉林 537000；3.广西农业科学院农业科技信息研究所，南宁 530007；4.广西农业科学院植物保护研究所，南宁 530007)

【研究意义】水稻白叶枯病由革兰氏阴性菌黄单孢菌[Xanthomonasoryzaepv.oryza(Xoo)]引起，是水稻的重要细菌性病害，可造成高达50%的水稻产量损失[1-2]。细菌性条斑病(简称细条病)由革兰氏阴性菌黄单孢菌[X.oryzaepv.oryzicola(Xoc)]引起，是属于检疫对象的细菌性病害，暴发时水稻产量损失高达40%。利用抗性基因培育抗性品种是防治白叶枯病和细条病最经济有效的途径。我国白叶枯病抗性资源丰富，目前已从各类稻种资源中发现46个白叶枯病抗性基因[3]。细条病抗源在稻种资源中也较丰富，已经发现包括qBlsr5a在内的13个抗细条病QTLs，以及BLS1、bls2和Xo1等少数几个主效抗病基因[4-7]。白叶枯病和细条病病原菌属于黄单孢菌的2个变种，二者在形态特征、生物学特性及病害流行因素等方面均很相似。因此，筛选既抗白叶枯病又抗细条病的抗源，对丰富我国水稻育种遗传基础具有重要意义。【前人研究进展】目前发现的46个抗白叶枯病基因中已有16个主效基因获得克隆[3]。与白叶枯病研究相比，仅有BLS1、bls2和Xo1等少数几个主效抗细条病基因得到克隆和分子标记定位[4, 6-7]。其中，抗病基因bls2被精细定位在2号染色体上的RM13592和RM13599分子标记之间[4]；BLS1基因位于第6染色体，过表达BLS1或低表达其等位基因bls1，会减弱或增强水稻对条斑病细菌特定小种JZ-8的抗性，但过表达BLS1或低表达bls1基因都能提高水稻的非小种特异性广谱抗性，说明BLS1和bls1基因对Xoc菌株JZ-8的小种特异性抗性具有负调控作用，而对广谱抗性具有正调控作用和负调控作用[6]；Xo1是显性抗细条病基因，被定位在第4染色体1.09 Mbp范围内[7]。科学家们一直在上述基因中发掘和利用既抗白叶枯病又抗细条病的基因。姬广海和许志刚[8]、郭亚辉和许志刚[9]研究发现，在携带不同白叶枯病抗性基因的近等基因系中，xa5基因对白叶枯病和细条病均具有很强的抗性。基因克隆结果进一步说明，xa5(qBlsr5a)是兼抗白叶枯病和细条病的基因[5]。秦钢等[10]从285份水稻材料中鉴定出9份兼抗白叶枯病和细条病的水稻资源，其中2份携带xa5基因。刘驰等[11]利用xa5基因培育出兼抗白叶枯病和细条病的多抗、优质强恢复系桂恢663。xa5基因是隐性基因，可有效应用于常规水稻品种抗性改良，但用于杂交稻品种需同时改良多个亲本的抗性，xa5基因的应用效果会受到限制[12]。不同遗传背景能影响基因表达效果，因此也有研究认为xa5基因是部分显性基因[13]，能有效应用于杂交稻抗性改良。目前水稻育种存在遗传基础狭窄及同质化严重问题，导致难以培育出具有突破性的新品种[14]。广西普通野生稻具有丰富的遗传多样性，是水稻品种改良、培育新品种的重要基因源[15]，利用广西普通野生稻已培育出桂99和测253两个优良恢复系[16-17]。【本研究切入点】目前，针对xa5基因应用于杂交稻抗性改良的可行性研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】利用携带xa5基因的广西普通野生稻与感病亲本杂交，选出后代优良单株，再与优良主栽水稻品种杂交，培育强优势恢复系，组配出含xa5基因的杂交组合，并对其抗性进行鉴定评价，为丰富我国水稻抗性育种的遗传物质基础及水稻白叶枯病和细条病的抗性改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

普通野生稻DP3(也称PY3)、籼稻9311、不育系平丰A等供筛选xa5基因的102份水稻品种资源(材料)(包括广恢998)均由广西农业科学院水稻研究所抗性育种研究室收集提供。田间抗性鉴定接种所用菌株为华南籼稻区白叶枯强毒菌株(Ⅴ型)及抗性鉴定圃接种细条病菌株JZ-8(广西优势Ⅱ致病型)，均由广西农业科学院植物保护研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 抗病基因xa5检测 采用CTAB法[18]提取水稻叶片基因组DNA。根据Blair等xa5基因定位结果，结合IRGSP(2005)的SSR标记总表，选用与xa5紧密连锁且多态性好的分子标记RM17743作为检测标记。参考刘驰等[11]的方法进行抗病基因xa5的分子标记检测。引物(RM17743F：5′-CCTTGCTAGATCTGACGGTTCTC-3′，RM17743R：5′-AGGACTCTCTGTCACCGCTTCG-3′)由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。PCR反应体系10.0 μL：1.0 μL DNA模板，0.8 μL引物，1.0 μL Buffer，0.2 μL dNTP(10 mmol/L)，0.1 μLTaq酶(5 U/L)，ddH2O2补足10.0 μL；扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环；72 ℃再延伸5 min。PCR反应产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显色。

1.2.2 白叶枯病抗性鉴定 参照Kauffman等[19]的方法将培养的白叶枯病菌用无菌水稀释为1×109CFU/mL，采用人工剪叶法于分蘖盛期接种，每株接种5张叶片，21 d后根据Gu 等[20]的调查标准调查病斑长度和抗性级别，其中，病斑长度≤3.0 cm为抗(R)，3.0 cm﹤病斑长度≤6.0 cm为中抗(MR)，6.0 cm﹤病斑长度≤9.0 cm为中感(MS)， 病斑长度﹥9.0 cm为感(S)。

1.2.3 细条病抗性鉴定 参考岑贞陆等[21]的针刺法在水稻分蘖期接种，接种20 d后参考农秀美等[22]的方法，以病斑长度1.5 cm作为抗、感分界线，按照如下标准调查病情：免疫(I)，伤口无症状或仅有褐点；高抗(HR)，0.1 cm<病斑长度≤0.5 cm；抗(R)，0.5 cm<病斑长度≤1.0 cm；中抗(MR)，1.0 cm﹤病斑长度≤1.5 cm；感(S)，1.5 cm﹤病斑长度≤2.5 cm；高感(HS)，病斑长度﹥2.5 cm。

1.2.4 野栽型强恢复系选育 按照莫永生等[17]的方法，结合分子标记辅助选择选育野栽型强恢复系。

1.3 统计分析

水稻产量及米质相关数据来源于广西农业农村厅官方网站-种子管理专栏的区试结果(http://nynct.gxzf.gov.cn/gxzyl)，采用Excel 2003进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 xa5基因检测及抗性鉴定

利用与xa5基因紧密连锁的分子标记RM17743对普通野生稻DP3、籼稻9311和不育系平丰A等102份材料进行检测，其中，携带xa5基因的单株N36、广恢998和DP3等能扩增出小于100 bp的特异片段；经多次重复检测，新B未能扩增出相应的特异片段(图1)。由表1可知，从102份水稻材料中筛选出17份携带xa5基因的材料，分别为DP3、IRBB5、N36、广恢998、N663、金香B、群B、N776、N777、N779、桂99、华籼粳、P89、白R54、白R55、白R56和五山丝苗，xa5基因在102份材料中出现频率为16.7%。如表2所示，经抗性鉴定，DP3、IRBB5、N36、N776、N777、N779和P89等7份材料对白叶枯病和细条病均表现为抗；广恢998中抗细条病，感白叶枯病；桂99和华籼粳对白叶枯病和细条病均表现为感；其他材料对白叶枯病和细条病均表现为中抗以上抗性。7份兼抗白叶枯病和细条病水稻材料的获得为培育抗白叶枯病兼抗细条病水稻品种提供了重要基因资源。

M：DL2000 Marker；1：金刚30；2：9311；3：平丰A；4：IRBB5(阳性对照)；5：金刚30(阴性对照)；6～32：其他材料(其中，13为新B，16为N36，25为广恢998，26为DP3)；箭头所指为DNA片段大小M：DL2000 Marker；1：Jingang 30；2：9311；3：Pingfeng A；4：IRBB5(positive control)；5：Jingang 30(negative control)；6-32：The other materials(including 13 of Xin B，16 of N36，25 of Guanghui 998 and 26 of DP3)；Arrow line indicated the size of DNA fragment图1 xa5基因检测Fig.1 Detection of xa5 gene

表1 102份水稻材料的xa5基因检测

2.2 野栽型强恢复系野香占的选育过程

按照图2所示开展野栽型强恢复系野香占选育：2008年早造，以分子标记检测含有xa5基因并兼抗白叶枯病和细条病的普通野生稻DP3为父本，以9311为母本进行杂交获得杂交种，晚造种植杂交种并获得后代种子；2009年早造，大规模种植DP3×9311杂交组合的F2代植株2000株以上，结合分子标记选择，从中筛选获得农艺性状较优良的单株Y240-1，晚造以该单株为父本，以综合农艺性状优良的广恢998为母本进行杂交，获得杂交种；2010年早造种植Y240-1×广恢998的F1群体，2010年晚造大规模种植F2群体(2000株以上)，通过分子标记选择，从中选出优良单株自交形成不同株系；2011年早造，从Y240-1×广恢998的F3群体开始，通过系谱法，结合分子标记选择，于2014年晚造筛选出携带纯合型xa5基因的株系，包含N717、N776、N812和N918的4个优良株系(图3)；4个优良株系继续自交，并分别与平丰A、丰田1A和思丰A等不同不育系测交，经过优中选优，至2017年晚造，筛选出杂种优势强、农艺性状优良的株系N776，并将该恢复系命名为野香占。野香占于2022年获得植物新品种权。

图2 野香占系谱图Fig.1 Pedigree diagram of Yexiangzhan

M：DL2000 Marker；1：DP3；2：9311；3：平丰A；4：IRBB5(阳性对照)；5：金刚30(阴性对照)；6～32：后代材料[其中，23、24、25和26分别为携带纯合型xa5基因的4个优良株系 N717、N776(野香占)、N812和N918]；箭头所指为DNA片段大小M：DL2000 Marker；1：DP3；2：9311；3：Pingfeng A；4：IRBB5(positive control)；5：Jingang 30(negative control)；6-32：The other materials[including 23(N717)，24(N776, Yexiangzhan)，25(N812) and 26(N918) indicated the 4 elite lines with homozygous of xa5]；Arrow line indicated the size of DNA fragment图3 xa5基因分子标记辅助选择检测 Fig.3 Molecular marker-assisted selection of xa5 gene

2.3 野香占的抗性反应

以IRBB5为抗病对照，金刚30为感病对照，利用白叶枯华南籼稻区强毒菌株(Ⅴ型)和细条病广西优势Ⅱ致病型菌株JZ-8对野香占、平丰A及野香占涉及的亲本DP3、9311和广恢998进行抗性鉴定。结果表明，携带纯合型xa5基因的DP3、IRBB5和野香占对白叶枯病和细条病均表现兼抗；经标记检测，携带xa5基因的广恢998感白叶枯病，中抗细条病；平丰A、9311和感病对照金刚30抗性反应一致，均表现为感白叶枯病、高感细条病(表2)。可见，野栽型兼抗白叶枯病和细条病恢复系野香占的选育有利于拓宽水稻遗传基础。

表2 水稻材料的抗性级别和平均病斑长度比较

2.4 强优势组合平丰优香占的评价

野香占与平丰A配制的感光杂交稻新组合平丰优香占于2022年通过广西壮族自治区农作物品种审定委员会审定(审定编号：桂审稻2022036号)。该组合2020和2021两年区试平均产量为493.96 kg/666.7 m2，比丰田优553(CK)增产4.96%，全生育期平均为121.4 d，比丰田优553(CK)长4.0 d；2021年多点生产试验全生育期平均121.3 d，比丰田优553(CK)长5.0 d，平均产量为477.18 kg/666.7 m2，比丰田优553(CK)增产2.88%，增产点比例达75%，米质达部标2级优质米标准。平丰优香占的抗性表现：稻瘟病抗性综合指数2020—2021年度分别为3.0和4.0，穗瘟损失率最高级3级；白叶枯病2020—2021年度分别为5级和3级；中抗稻瘟病、中感白叶枯病。为进一步科学评价携带xa5基因的野香占在白叶枯病和细条病抗性育种改良中的利用价值，以IRBB5为抗病对照，金刚30为感病对照，利用白叶枯华南籼稻区强毒菌株(Ⅴ型)和细条病广西优势Ⅱ致病型菌株JZ-8对野香占、平丰A及二者的杂交组合平丰优香占进行抗性鉴定。结果发现野香占的抗性反应与阳性对照IRBB5一致，二者对白叶枯病和细条病均表现为抗；平丰A的抗性反应与感病对照金刚30一致，均感白叶枯病、高感细条病；杂交组合平丰优香占对白叶枯病和细条病均表现中抗(表3)。根据对抗性级别和病斑长度的分析结果，携带xa5基因的野香占能组配出抗性比感病亲本得到明显改良的杂交组合，说明xa5基因具有部分显性效应，在杂交稻抗性改良中具有一定应用潜力。

表3 野香占、平丰A及其杂交组合平丰优香占的抗性表现

3 讨 论

目前发现的抗白叶枯病兼抗细条病基因为xa5，另一个可能是Xa17[8]。国内抗病基因xa5的主要来源为IRBB5。王祯等[23]利用与xa5基因紧密连锁的分子标记对103个杂交稻亲本进行检测，未发现携带xa5基因的亲本。史波[24]对79份主栽水稻品种进行分析，也未发现携带xa5基因的水稻品种。秦钢等[10]检测9份兼抗白叶枯病和细条病的水稻材料，仅发现1份材料(L661)携带xa5基因。而L661的亲本之一就是IRBB5，因此推测L661的xa5基因极可能来自IRBB5。夏志辉等[25]对9份普通野生稻材料进行分析，未发现携带xa5基因的材料。李定琴等[26]对普通野生稻、药用野生稻和疣粒野生稻进行鉴定，也未发现携带xa5基因的野生稻。但随着研究的深入，近两年来陆续发现除IRBB5外的一些xa5基因抗源，如杨雅云等[27]研究发现7个居群的云南药用野生稻均含有xa5基因，宗凯等[28]在栽培稻和普通野生稻中检测出xa5基因。本研究发现，普通野生稻DP3和栽培稻广恢998均携带xa5基因，但进一步进行抗性鉴定发现广恢998不抗白叶枯病，说明广恢998不一定携带xa5基因，原因是本研究所用的分子标记RM17743与xa5基因编码区有约80 kb的物理距离，因此检测结果不够精确，导致广恢998可能的假阳性。为提高检测结果的精确度，建议在以后的工作中开发应用简便功能型分子标记。本研究获得的携带xa5基因普通野生稻DP3有利于丰富该基因的遗传基础。

一般认为xa5基因是隐性基因，具有广谱抗性，对白叶枯病大部分生理小种和细条病均具有抗性[8-9，29]。xa5基因在常规稻品种抗性改良中已得到有效利用，如成太辉等[30]研究报道利用来自IRBB5的xa5基因已育成白香占、白粳占和白丝占等抗白叶枯病常规水稻品种。关于xa5基因的显性和隐性问题，Li等[13]研究认为，xa5基因是部分显性或具有加性效应，曾列先等[31]利用高抗白叶枯病的IRBB5(携带xa5基因)与高感白叶枯病(9级)的五丰A、吉田A和金刚30杂交，所得相应F1植株的抗性(7级)均高于这3个高感白叶枯病亲本，进一步说明xa5基因具有一定的加性效应。xa5基因部分显性或具有加性效应暗示该基因在杂交水稻抗性育种改良中具有应用潜力，如刘驰等[11]利用分子标记辅助选择培育出抗白叶枯病兼抗细条病的强恢复系桂恢663，本研究对包括野生稻在内的102份水稻品种资源进行筛选，利用优良亲本进行杂交，再通过分子标记辅助选择，也选育出携带xa5基因的野栽型抗白叶枯病兼抗细条病强恢复系野香占。野香占与平丰A所配制的杂交组合平丰优香占中抗白叶枯病和细条病，病斑长度比感病亲本平丰A明显降低，而抗性水平比平丰A高1～2个级别，说明xa5基因具有部分显性效应，可有效应用于杂交水稻的抗性改良育种。

遗传基础狭窄、品种间同质化严重及突破性新品种稀缺是目前水稻育种面临的重要问题[12]。普通野生稻是亚洲栽培稻的祖先，保留其丰富的遗传多样性对充实水稻基因源库、拓宽水稻遗传基础及进行现代水稻遗传育种改良均具有极其重要的意义。广西是普通野生稻分布点最多的省(区)之一，具有遗传多样性丰富的普通野生稻，利用广西普通野生稻已培育出一些突破性的优良品种，如桂99和测253[16-17]。本研究以携带xa5基因的普通野生稻DP3为亲本，通过杂交和分子标记辅助选择，选育出含有四分之一普通野生稻血缘、兼抗白叶枯病和细条病的强恢复系野香占，野香占与感病不育系平丰A可组配出强优势组合平丰优香占，该组合中抗白叶枯病和细条病，产量比丰田优553增产4.96%，米质达到部标二级优质米标准。

4 结 论

xa5基因具有部分显性效应，可用于杂交水稻育种改良；培育出含有野生稻血缘的野香占能组配出强优势水稻杂交组合，中抗白叶枯病和细条病，有助于丰富和拓宽水稻育种遗传基础。