虎杖苷对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响

王春美，朱 平，祁文静，任艳娇，盛光耀，卢 洁

1)郑州大学第一附属医院儿童医院 郑州 450052 2)郑州大学公共卫生学院卫生统计学教研室 郑州 450001

神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是来源于肾上腺髓质或椎旁交感神经节的未成熟胚胎性肿瘤，是最常见的儿童颅外实体肿瘤，占儿童期肿瘤死亡总数的15%；该病恶性程度高，总体预后差，尤其是3期和4期患儿，长期生存率<30%[1]，新的治疗策略亟待发现。近年来，越来越多的人认识到植物性化学物质的重要性。虎杖苷是从中药虎杖的干燥根茎中提取的单体，具有抑制血小板聚集、降血脂、扩张血管、抗休克、肝脏保护、神经保护、肺脏保护、抗感染、免疫调节等作用[2-6]。近年研究[7-11]发现，虎杖苷亦有抗肿瘤作用，但关于其与NB的研究报道少见。本研究以NB细胞株SH-SY5Y为研究对象，基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨虎杖苷对NB细胞增殖及凋亡影响的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器SH-SY5Y细胞株(中科院上海细胞研究所)，虎杖苷(北京Solarbio公司)溶解于DMSO中，稀释至10 mmol/L，4 ℃储存，实验过程中根据需要稀释至不同浓度。DMEM培养基(美国Corning公司)，胎牛血清(美国Invitrogen公司)，DMSO(上海索宝生物科技有限公司)，兔抗人PI3K、AKT、p70 S6K、p-p70 S6K和鼠抗人p-AKT、mTOR、p-mTOR、GAPDH抗体(美国Abcam公司)，山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP抗体、CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)，Annexin V-FITC凋亡检测试剂、细胞周期检测试剂盒(美国BD公司)。CO2培养箱(德国GMBH公司)，酶标仪(美国Bio-Tech Instruments公司)，流式细胞仪(美国Beckmen-Coulter公司)，离心机(上海安亭科学仪器厂)，POWER/RAC 200半干式电转移槽(美国Bio-Rad公司)。

1.2 SH-SY5Y细胞的培养用含体积分数10%胎牛血清、0.05 mmol/L 2-巯基乙醇、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养SH-SY5Y细胞。将处于对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3 SH-SY5Y细胞增殖的CCK-8法检测在96孔板中接种SH-SY5Y细胞悬液(100 μL/孔)，100 μL约含4 000个细胞。将培养板放在培养箱中培养，待细胞贴壁后，加入不同浓度的虎杖苷(0.00、1.90、3.90、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00 μmol/L)处理24、48和72 h，每组设置5个平行复孔；每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h后，酶标仪检测450 nm波长处的吸光值(A)。细胞增殖活力=[(A加药-A空白)/(A0加药-A空白)]×100%(A加药：细胞、CCK-8溶液和药物；A空白：培养基和CCK-8溶液；A0加药：细胞和CCK-8溶液)。

1.4 SH-SY5Y细胞凋亡的双染法检测将处于对数生长期的细胞接种于6孔板中过夜孵育，设立空白对照组和虎杖苷(1 120.00 μmol/L)组，每组设3个平行复孔，72 h后PBS洗涤孔板中细胞1次，弃去上清，加入胰蛋白酶消化细胞，完全培养基终止消化，1 300 r/min离心3 min，弃去上清；PBS洗涤细胞沉淀1次，1 300 r/min离心3 min，收集细胞；1×Binding Buffer 洗涤细胞沉淀1次，1 500 r/min离心3 min，收集细胞；200 μL细胞凋亡缓冲液重悬细胞沉淀，调整细胞悬液终密度为[(1～10)×106个]/mL，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，染色15 min；加入800 μL细胞凋亡缓冲液重悬细胞，混匀后上流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.5 SH-SY5Y细胞周期的流式细胞仪检测离心收集空白对照组和虎杖苷处理72 h的细胞，4 ℃预冷PBS洗涤1次，1 500 r/min离心5 min，弃上清；加入4 ℃预冷的体积分数70%乙醇1 mL固定过夜；次日1 500 r/min离心5 min，弃去固定液，加入0.5 mL的PBS重悬细胞；依次加入RNaseA(终质量浓度50 mg/L)、500 μL PI(100 mg/L)，避光孵育30 min；上流式细胞仪检测，CellQuest软件检测G0/G1、S和G2/M期的细胞。实验重复3次。

1.6 SH-SY5Y细胞中PI3K/AKT/mTOR/p70 S6K信号通路相关蛋白表达的Western blot检测离心收集空白对照组和虎杖苷处理72 h的细胞，冰上静置30 min以充分裂解，12 000 r/min离心5 min，迅速将上清(蛋白提取液)转移至预冷新EP管中，即为细胞总蛋白。Bradford法测定蛋白浓度。蛋白样本经100 g/L的SDS-PAGE电泳分离，半干转至PVDF膜上，含50 g/L脱脂奶粉的TBST溶液4 ℃封闭过夜。一抗(PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p70 S6K、p-p70 S6K、GAPDH抗体，其中p-p70 S6K按1∶500稀释，PI3K、p-AKT、p-mTOR按1∶1 000稀释，p70 S6K按1∶2 000稀释，AKT、mTOR、GAPDH按1∶3 000稀释) 室温孵育2 h，TBST洗涤10 min×3次，TBS洗涤10 min×1次，相应的二抗(按1∶3 000稀释) 室温孵育2 h，TBST洗涤10 min×3次，TBS洗涤10 min×1次，ECL发光液处理后暗室内曝光，胶片于室温下自然风干，扫描仪扫描结果保存，Image J软件分析灰度值结果。实验重复3次。

1.7 统计学处理采用SPSS 25.0进行统计分析。本研究中所有数据分布符合正态性且方差齐，应用两独立样本t检验比较2组间细胞凋亡率、细胞中PI3K/AKT/mTOR/p70 S6K信号通路相关蛋白表达水平的差异，应用多元方差分析比较2组间细胞周期(G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例)的整体差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 虎杖苷对SH-SY5Y细胞增殖的影响用不同浓度的虎杖苷分别处理SH-SY5Y细胞24、48和72 h后，结果显示，在72 h时，虎杖苷对SH-SY5Y细胞有抑制作用，其IC50约为1 120.00 μmol/L。因此选择该浓度的虎杖苷处理SH-SY5Y细胞72 h用于后续实验。

2.2 虎杖苷对SH-SY5Y细胞凋亡的影响虎杖苷处理SH-SY5Y细胞72 h后，细胞凋亡率为[(8.83±0.75)%]，高于空白对照组[(4.28±0.73)%]，差异有统计学意义(t=8.710，P<0.001)。

2.3 虎杖苷对SH-SY5Y细胞周期的影响结果见表1。由表1可知，虎杖苷处理SH-SY5Y细胞72 h后，细胞周期分布与空白对照组相比差异有统计学意义(P=0.006)。虎杖苷组S期细胞比例上升，G0/G1期的细胞比例下降；2组间G2/M期的细胞比例差异无统计学意义(P=0.387)。

表1 2组细胞周期的比较*(n=3) %

2.4 虎杖苷对SH-SY5Y细胞中PI3K/AKT/mTOR/p70 S6K信号通路相关蛋白表达的影响结果见图1、表2。由表2可知，虎杖苷处理SH-SY5Y细胞72 h后，细胞中PI3K、AKT、p-AKT、p-p70 S6K蛋白表达降低(P均<0.05)，而mTOR、p-mTOR、p70 S6K蛋白的表达无明显变化。

图1 2组细胞中PI3K/AKT/mTOR/p70 S6K信号通路相关蛋白表达的比较

表2 2组细胞中PI3K/AKT/mTOR/p70 S6K信号通路相关蛋白表达的比较(n=3)

3 讨论

目前发现的155种小分子抗癌药物中，47%是天然植物或者它们的衍生物[12]，因此植物性化学物质被认为是具有广泛前景的抗癌药物的重要来源。植物来源的紫杉醇、长春新碱、喜树碱等早已广泛应用于临床[13]，而冬凌草甲素、姜黄素、黄连素等也已被证实体外具有抗肿瘤作用[14-15]。虎杖苷是从虎杖中提取出来的具有多种生物活性的物质，具有广泛的抗肿瘤作用，可有效抑制乳腺癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、白血病等细胞株的增殖，并诱导细胞凋亡[7-11]，但有关其与NB的研究报道少见。

本研究结果显示，虎杖苷处理72 h后可显著抑制SH-SY5Y细胞的增殖，IC50为1 120.00 μmol/L，提示虎杖苷需要在高浓度的环境中才能发挥其对SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用。既往研究[16]结果表明，白藜芦醇在500～1 000 μmol/L浓度范围内可抑制SH-SY5Y细胞增殖；而虎杖苷是白藜芦醇和葡萄糖结合的产物，二者在体内可以相互转化，与白藜芦醇相比，虎杖苷更容易被吸收、更能耐受酶的氧化作用、可溶于热水、可通过主动转运的方式进入细胞内，因此具有比白藜芦醇更高的生物活性。但本实验得到的IC50结果提示，对于SH-SY5Y细胞而言，虎杖苷并未表现出比白藜芦醇更强的活性，其原因有待于进一步探讨。

使用1 120.00 μmol/L的虎杖苷处理SH-SY5Y细胞72 h后，细胞凋亡率升高，同时细胞周期出现S期阻滞，G0/G1期的细胞比例下降，提示虎杖苷可能是通过阻滞细胞周期和诱导凋亡发挥抗肿瘤作用。

PI3K/AKT/mTOR是细胞内重要的信号转导途径，参与调控细胞增殖、生长、分化及凋亡等多个环节，影响多种恶性肿瘤的发生、发展及转归，并且与肿瘤细胞的耐药相关[17]，针对该信号通路相关分子的靶向药物研究是近年研究的热点。既往研究[18-20]表明，NB细胞中存在PI3K/AKT/mTOR信号通路的异常活化，是导致该肿瘤发生的重要机制之一。本研究结果显示，使用1 120.00 μmol/L的虎杖苷处理SH-SY5Y细胞72 h后，PI3K、AKT、p-AKT、p-p70 S6K蛋白表达降低，而mTOR、p-mTOR蛋白的表达无明显变化，提示PI3K/AKT信号通路的抑制可能是虎杖苷抑制SH-SY5Y细胞增殖，并诱导细胞凋亡的重要机制。但本研究结果不支持虎杖苷通过抑制mTOR蛋白的表达而影响p-p70 S6K蛋白表达，具体机制我们将在后续的实验中进一步探讨。

综上，本实验发现了虎杖苷能够在体外抑制NB细胞的增殖、阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡，其作用机制可能是通过调节PI3K/AKT信号通路而实现。在此基础上，之后拟进一步研究虎杖苷引起PI3K/AKT磷酸化水平降低的分子靶点，以及其抑制NB细胞增殖、诱导细胞凋亡的其他可能机制。