基于生物信息学对过敏性紫癜靶点的筛选

马 跃， 孔 涵， 张善云， 刁娟娟

(1.山东中医药大学，山东 济南 250014；2.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011)

过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)是一种以IgA沉积为主的系统性小血管炎[1]。学龄前期及学龄期儿童最为多见，发病率呈逐年上升趋势[2]，可引起腹痛、紫癜、关节痛等，且部分患者伴有肾损伤等症状，甚至可以发展为肾功能不全。过敏性紫癜的病因和发病机制尚不完全清楚，可能与体液免疫紊乱、T细胞亚群功能失调、凝血与纤溶机制紊乱等有关[3]。临床上多应用抗感染、抗过敏、抗血小板聚集等的综合疗法。对于存在严重腹痛、关节痛等症状，应用糖皮质激素类药物，但非选择性抑制作用导致对免疫系统与代谢产生改变，导致白内障、高血压和体重增加等，同时只能用于缓解症状，不能降低肾损伤的风险，停药后复发率较高[4]。因此，需要明确过敏性紫癜的发病机制，探索可能的靶点和靶向治疗药物，对于制定更有效的诊断和治疗策略至关重要。

1 方法

1.1 检索疾病靶点 在NCBI数据库中，以“Henoch-Schonlein purpura”为关键词，并且限定物种为“Homo sapiens”，检索出与过敏性紫癜相关的基因。

1.2 筛选KEGG通路 DAVID是一个在线生物学知识库，为研究人员提供一套全面的功能注释工具[5]。将检索出的过敏性紫癜疾病相关的靶点，输入DAVID数据库，限定获得过敏性紫癜相关靶点的KEGG信号通路。为了使结果具有高度可靠性，因此筛选出P<0.01的疾病通路。

1.3 构建蛋白互作网络 STRING是一个用于探索和分析蛋白质之间相互作用在线工具[6]。统计富集在每条通路上的过敏性紫癜的靶点，筛选出富集在P<0.01通路上的非冗余靶点和出现频次高(频率>10)的靶点，同时在CTD数据库验证非冗余靶点与疾病的相关性。非冗余靶点通过STRING数据库，筛选出度值较高的高度值非冗余靶点。

1.4 核心靶点筛选 将筛选出的高度值非冗余靶点与高频靶点取交集，作为过敏性紫癜的重要靶点。再将重要靶点通过STRING数据库获取高度值的核心靶点。

1.5 筛选中药和中医症状 将核心靶点依次输入Symmap数据库查找每个核心靶点所对应的P<0.05的Herb和TCM symptom相关条目，导出、筛选并分析高频次的中药、中药分类以及中医症状。

1.6 核心靶点的GO功能和KEGG通路分析 将核心靶点进行GO功能分析和KEGG通路分析，获得GO功能的生物过程(BP)，细胞组分(CC)，分子功能(MF)以及相关KEGG信号通路。

2 结果

2.1 筛选靶点基因 在NCBI数据库中共筛选出75个过敏性紫癜靶点。

2.2 筛选KEGG通路 获得过敏性紫癜相关靶点P<0.05的KEGG通路54个，P<0.01的KEGG信号通路40个，见图1。

2.2.1 细胞因子-细胞因子受体交互作用 细胞因子-细胞因子受体交互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction，CCI)网络是机体信号转导系统的重要组成，在改善机体炎性反应及调节免疫功能中有重要作用[7]。CCI主要富集表现在趋化因子和TNF家族中，通过趋化因子信号梯度，在过敏性紫癜的病理过程中起重要作用。CXC趋化因子配体16(CXCL16)主要在抗原提呈细胞表面表达，可以通过受体特异性结合激活T细胞、自然杀伤细胞进而提高T细胞的增殖、迁徙及浸润，促进局部的炎症反应[8-9]。同时INF、TNF等炎症细胞因子也可以进一步促使CXCL16的表达水平上调，调控炎症水平。通过观察过敏性紫癜患者血清、尿液中CXCL16，发现CXCL16可以作为早期诊断过敏性紫癜的敏感指标，且CXCL16水平与尿蛋白定量呈正相关性，也可作为预测紫癜性肾炎病情严重程度的指标之一[10]。

2.2.2 T细胞受体信号通路 T细胞受体信号通路在形成T细胞功能和免疫突触中起到关键作用，在抵抗感染的适应性免疫反应中发挥着至关重要的作用[11]。T细胞受体激活CD4+T细胞，分化为Th1、Th2和Th17细胞亚群和Treg细胞。通过研究过敏性紫癜患者外周血T细胞亚群及其相关细胞因子等的变化，发现过敏性紫癜患者存在Th1/Th2失衡，大量合成、分泌IgA，出现异常免疫应答引起免疫损伤[12]。通过T细胞受体通路调节T细胞增殖，能够改善过敏性紫癜的细胞及体液免疫紊乱[13]。霉酚酸酯可能通过调控T-bet/GATA3表达，恢复过敏性紫癜小鼠Th1/Th2平衡，控制并改善过敏性紫癜的症状[14]。Th1/Th2、Th17/Treg的平衡在免疫调节中发挥重要作用。因此，在过敏性紫癜病理过程中，细胞因子失衡对机体造成的潜在损伤不容忽视，应当在治疗中密切监测。

2.2.3 Toll样受体信号通路 TLR2、TLR4是TLRs家族的两个主要成员，与相应的配体接触后，通过信号传导促进IL6、IL8、IL10等，引起中性粒细胞趋化聚集，使毛细血管通透性增加导致炎症损伤，促进免疫功能紊乱，与过敏性紫癜的发生发展密切相关[15]。此外TLR通过多种机制参与Th1/Th2免疫应答平衡，对维持内环境稳定具有重要意义。通过调控Toll样受体信号通路，提高TLR2蛋白表达率，能够改善细胞免疫功能[16]。因此以TLR为靶点治疗过敏性紫癜可能是一种新的治疗策略。

2.2.4 NF-κB信号通路 TNF-α可以通过激活NF-κB，抑制内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的释放，活化的NF-κB诱导TNF-α等促炎因子的产生[17]。NF-κB影响下游氧化应激反应及细胞免疫应答，通过上调MMP-3、MMP-9的表达，可降解血管系膜使得内皮细胞通透性增强，造成血管内皮屏障损伤，促进炎症因子的产生[18]。

2.3 PPI网络构建 将40条通路整理归类并统计后获得44个非冗余靶点、高度值非冗余靶点18个、高频靶点10个。同时在CTD数据库对非冗余靶点与疾病的相关性进行验证并绘制热图，相关性分数越高代表该靶点与疾病的相关性越好(见图2)。非冗余靶点和高频靶点蛋白互作图见图3～4，其中度值越大，颜色越深且图标越大。

2.4 核心靶点筛选 过敏性紫癜核心靶点10个，分别为IL10、IL6、TNF、CXCL8、TLR4、TLR2、IL18、IL1B、IFNG、CD40LG，利用STRING数据库进行蛋白相互作用，获得PPI网络(见图5)。

2.5 筛选中药和中医症状 含有大于7项的中药共70味，20种中药分类主要有清热解毒药、活血祛瘀药、清热燥湿药、清热泻火药、补益药(阳、气、阴)、祛风湿散寒药、理气药等，中药主要有金银花、连翘、黄芪、板蓝根、小蓟等，同时获得P<0.05的高频词中医症状28个，主要有斑疹、关节痛、腹痛、头痛等(图6～7)。

2.6 GO功能和KEGG通路分析 通过GO分析，过敏性紫癜的关键靶点主要涉及其对细胞因子的正调控、MyD88依赖的Toll样受体信号转导，中性粒细胞的趋化性，T细胞增殖的正调控、一氧化氮生物合成过程等生物过程(图8)。通过KEGG通路分析，这些重要靶点在细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路等信号通路中发挥重要作用(图9)。

4 讨论

中医诊疗方案将过敏性紫癜分为风热伤络、血热妄行、湿热痹阻、阴虚火旺、气不摄血、气滞血瘀，以“湿、热、瘀”为主的辨证思路，治疗以祛湿清热、凉血化瘀为主。通过对重要靶点基因预测的中药及其归类进行统计分析，发现以清热解毒药、活血祛瘀药频数最高，如金银花、连翘、黄芪等。金银花、连翘具有广谱抗菌、抗病毒、解热镇痛及抑制毛细血管通透性的作用[19]。由金银花、连翘组成的银翘散，为风热伤络的主方。对过敏性紫癜采用营卫论治、三焦辩证共同选方银翘散加减为治卫气分证与上焦证，临床疗效佳[20-21]。近年来血瘀理论的提出在过敏性紫癜的诊疗进程中尤为重要，以小蓟为主要药物的经典方剂小蓟饮子，为血热妄行证的首选方剂。许华教授[22]自拟消癜汤加减，其中小蓟、牡丹皮等具有活血化瘀药物的使用，更体现了“热毒”致瘀、从瘀论治过敏性紫癜的观点。黄芪具有抗氧自由基作用，保护肾小球基膜屏障、改善血管微循环[23]。补中益气汤、归脾汤、黄芪颗粒、玉屏风散可以健脾益气补血，有效调节患儿免疫功能，有效降低过敏性紫癜复发率[24-26]。过敏性紫癜当分为两期论治，正虚阶段多见于阴虚火旺、气阴两虚，常应用补益药类似黄芪、桑寄生、女贞子等，邪实阶段宜用疏风、清热、凉血等治法，常选用金银花、连翘、赤芍等清热凉血之品[27]。过敏性紫癜以斑疹(紫黑、色淡)、关节疼痛(刺痛、肿痛、钝痛)、腹痛(绵绵、冷痛)、发热(烘热、低热、身热)、五心烦热、头痛等为主要表现，对应病机体现血瘀、气滞、气阴不足等。中医以辨证论治为基础，临床选方上具有灵活性，多成分，多靶点，多通路发挥作用。

免疫炎症反应及氧化应激在过敏性紫癜的发病机制和进展中起关键作用[28]。早期清除急性期的炎症介质可能有助于缓解肾脏损害并改善过敏性紫癜的临床症状。IL6的表达水平与过敏性紫癜的发生有相关性，并且与肾脏受累的严重程度直接相关[29]。通过血流灌注可有效减少IL6、TNF-α等，改善肾脏损害与病情发展[30]。过敏性紫癜患儿本身存在T细胞功能紊乱，Th17过度活化，Treg生成减少，IL6等过度表达破坏Th17/Treg平衡[31]。B10细胞与过敏性紫癜的发生和严重程度有关，CD40-CD40L信号通路可诱导B细胞产生IL10，刺激调节性B细胞的产生[32]。在TWEAK的刺激下产生促炎作用，导致血管周围白细胞浸润与内皮损伤[33]。阻断TWEAK能抑制炎症浸润减少趋化因子的产生，这可能为过敏性紫癜治疗提供新的治疗策略。达培酮通过抑制IL-8的释放与趋化作用，破坏IgA和IgG的合成，起到抗氧化剂清除剂、抗炎作用，可作为过敏性紫癜的替代疗法[34]。免疫复合物激活相关信号通路抑制IL6、IL10、TNF等细胞因子的释放及免疫应答。

本研究对过敏性紫癜进行生物信息学分析，初步确定过敏性紫癜发病中的关键靶点和途径，为过敏性紫癜的精准治疗提供理论依据。