加勒比松松脂组分分析及高特征组分无性系选择

谢俊康，冯源恒，吴东山，杨章旗

（广西壮族自治区林业科学研究院 国家林业局马尾松工程技术研究中心/广西马尾松工程技术研究中心，广西 南宁 530002）

加勒比松Pinus caribaea又称古巴松，为松科松属乔木，原产地为中美东部的沿海地区、古巴西部等，是重要的用材、纸浆材和采脂树种，具有生长快、抗风能力极强、适应性强、经济价值高等特点[1-2]。于20世纪60年代后期开始引入我国，在广西、广东及海南种植。目前，加勒比松已经成为南方区域人工造林的重要树种之一，也是退化生态系统植被重建的先锋树种[3-4]。

松脂是重要的化工原料，其组分复杂，不同组分有着不同的用途。松脂经水蒸气蒸馏后可分离出松节油和松香，松节油可直接用于医药、消毒、杀菌等领域[5-7]。松节油单离出的α-蒎烯、β-蒎烯可用于香料、农药中间体等精细化工品的合成[8-10]，β-水芹烯则在手性配体、杀虫剂、合成药物中间体等领域具有极高的利用价值[11]。松香是一种混合物，其作用受到一定限制，价格也比较低，但是经过单离后得到的单体树脂酸也具有较高的应用价值，比如脱氢枞酸手性合成药物、枞酸两性表面活性剂、枞酸微胶囊膜、防霉剂、杀菌农药等[12-23]。由于单离成本较高、过程也较复杂，对比普通松脂原料，高附加值组分含量高的松脂原料在生产加工时，产物得率大、纯度高，对松脂加工厂提高经济效益有较好的作用。加勒比松松脂产量较大，但目前对于加勒比松松脂组分的研究报道较少，为合理有效利用这一优质树种的松脂资源，有针对性地对其松脂组分进行研究、选择及改良是非常有必要的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料取自广西南宁市林业科学研究所（108°00′E，23°10′N），该地属热带北缘季风气候，干湿季节明显，年平均气温21.5℃。选择立地条件相同的2#基因库和6#基因库共31 个加勒比松无性系（107E、115E、116E、117E、120E、121E、122E、124E、126E、790E、340E、342E、344E、345E、347E、348E、349E、351E、352E、353E、355E、356E、614E、358E、359E、360E、361E、362E、346E、354E 和357E）作为研究对象。

1.2 试验方法

采用钻孔采脂的方式进行松脂采集。使用带口径为10 mm 钻头的木工电钻，在树干向阳面钻取深度约为10 mm 的圆孔，将木屑清理后斜插入孔径适合的离心管，确保松脂不外漏。松脂收集结束后取适量用于气相色谱—质谱联用（CG—MS）和气相色谱（GC）检测[14]。

使用Bruker 气相色谱三重四级杆质谱仪（SCIONSQ—TQ）和岛津Nexis GC—2030 气相色谱仪对松脂样品进行分析。通过GC—MS 仪器自带的质谱检索系统和文献查找进行定性分析[15-20]，通过GC 色谱峰面积归一化法对其进行定量分析。具体操作步骤如下：取少量松脂样品至5 mL 具塞试管中，加入适量无水乙醇溶解，然后滴入1～2滴0.5%的酚酞试液，用25%四甲基氢氧化铵溶液将树脂酸甲酯化（滴加至溶液呈现微红色，30 s 不褪色），然后加入干燥剂除水，用0.22 μ有机过滤头将具塞试管中的试液过滤并转移至气相色谱瓶中待测。

GC—MS 测试条件如下：色谱柱为DB—5 毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm)，检测器为氢火焰离子检测器（FID），程序升温方法为起始温度60℃，保持2 min，以4℃/min 升温到200℃，保持2 min，再以2℃/min 升温到250℃，保持10 min 至结束；汽化室和检测器温度分别为260℃和280℃；载气为高纯氮气（纯度99.999%）；载气柱流量为2.90 mL/min；分流比为1∶100；进样量为0.50 μL；电子轰击源为EI，电子能量为70eV，离子源温度为250℃，接口温度为250℃，溶剂延迟时间为3 min。

GC 测试条件如下：色谱柱为岛津RTX—5 毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm)，检测器为氢火焰离子检测器（FID），程序升温方法为起始温度60℃，保持2 min，以4℃/min 升温到200℃，保持2 min，再以2℃/min 升温到250℃，保持10 min 至结束；汽化室和检测器温度分别为260℃和280℃；载气为高纯氮气（纯度99.999%）；载气柱流量为2.90 mL/min；分流比为1∶100；进样量为0.50 μL。

采用SPSS 25.0 软件进行独立样本t-test 检验、方差分析、Pearson 相关性分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 加勒比松松脂组分特点

通过GC—MS、GC 分析发现，在测试的31个加勒比松无性系松脂样品中，有3 份样品（346E、354E、357E）中含有3-蒈烯组分，其余样品中均未发现3-蒈烯组分。根据松脂化学组分的不同可将加勒比松无性系分为两类（松脂组分中不含3-蒈烯组分的无性系为第1 类，松脂组分中含3-蒈烯组分的无性系为第2 类）。两类加勒比松松脂组分和相对含量如表1 所示。第1 类加勒比松松脂组分中共检测和鉴定出18 种组分，其中单萜8 种，树脂酸组分8 种。第2 类的松脂组分比第1 类多出1 种（3-蒈烯）。第1 类松脂中平均相对含量大于1%的组分有10 种，分别是α-蒎烯（25.388%）、β-蒎烯（3.872%）、β-水芹烯（15.044%）、湿地松酸（2.561%）、山达海松酸（1.322%）、异海松酸（6.470%）、长叶松酸/左旋海松酸（25.950%）、脱氢枞酸（1.405%）、枞酸（5.079%）和新枞酸（9.322%），相对含量取值范围分别为12.813%～37.599%、0.519%～13.857%、2.836%～28.781%、1.456%～ 4.022%、0.440%～3.753%、2.868%～12.486%、20.856%～39.244%、0.683%～2.062%、3.253%～7.070%和6.936%～16.852%。第2 类松脂中平均相对含量大于1%的组分有12 种，分别是α-蒎烯（9.684%）、β-蒎烯（5.003%）、月桂烯（1.026%）、3-蒈烯（13.528%）β-水芹烯（11.374%）、萜品油烯（1.407%）、湿地松酸（3.791%）、山达海松酸（2.279%）、异海松酸（8.396%）、长叶松酸/ 左旋海松酸（24.721%）、枞酸（5.670%）和新枞酸（9.365%），相对含量取值范围分别为9.372%～10.228%、3.743%～6.652%、0.958%～1.078%、12.465%～15.646%、10.526%～11.867%、1.276%～1.565%、3.080%～4.231%、1.749%～2.589%、7.016%～9.538%、22.845%～26.448%、5.599%～5.712%和9.137%～9.701%。

表1 两类加勒比松松脂组分数据Table 1 Two types of Pinus caribaea resin components %

通过独立样本t检验分析了两类加勒比松松脂中相对含量较高组分的差异显著性，结果如图1 所示。在单萜部分，两类加勒比松松脂的β-蒎烯和β-水芹烯相对含量无显著差异，虽然第1 类松脂中α-蒎烯相对含量极显著高于第2 类，但是第2 类松脂中含有较高含量的3-蒈烯，使得总的单萜相对含量差异不显著。在树脂酸部分，两类加勒比松松脂中树脂酸组分和相对含量均相近，仅脱氢枞酸和枞酸相对含量具有显著差异，其他树脂酸组分相对含量和总的树脂酸相对含量均无显著差异。

图1 两类加勒比松松脂主要组分的相对含量Fig.1 Relative contents of the main components of two types of Pinus caribaea resin

通过Pearson 相关性分析加勒比松松脂中各个组分间的相关性。表2 为第1 类加勒比松松脂组分相关系数矩阵。由表2 可知，在第1 类松脂中α-蒎烯相对含量和单萜总含量呈极显著正相关，和β-水芹烯相对含量呈显著负相关，和β-蒎烯相对含量相关性不显著。β-水芹烯相对含量与β-蒎烯相对含量呈显著负相关。说明单萜中α-蒎烯相对含量占主导地位，β-水芹烯和β-蒎烯的相对含量呈现此消彼长的趋势。由于第2 类加勒比松无性系样本较少，因此，未进行相关性分析。

表2 第1 类加勒比松松脂组分相关系数矩阵†Table 2 Correlation coefficient matrix of pine resin components of category 1 Pinus caribaea

2.2 高附加值组分无性系的选育

在加勒比松松脂中，附加值较高、相对含量较大的组分有α-蒎烯、β-蒎烯和β-水芹烯。第2类加勒比松无性系松脂中单萜和β-水芹烯的相对含量平均值小于第1 类且差异不显著，α-蒎烯相对含量显著低于第2 类。因此在选择高含这些组分的无性系时，暂不考虑第2 类加勒比松无性系。但是第2 类加勒比松无性系中3-蒈烯相对含量达12%以上，当需要3-蒈烯组分时，第2 类加勒比松无性系可以提供较优质的松脂原料。

在第1 类加勒比松无性系中选育时，以α-蒎烯相对含量大小为变量，利用SPSS 25.0 软件进行系统聚类分析，所得树状图如图2 所示。图2 中无性系编号1～28 分别对应无性系107E、115E、116E、117E、120E、121E、122E、124E、126E、790E、340E、342E、344E、345E、347E、348E、349E、351E、352E、353E、355E、356E、614E、358E、359E、360E、361E 和362E。由图2 可知，按照α-蒎烯相对含量大小可将第1 类加勒比松分为高含量、中含量等和低含量3 组。高含量组的无性系有356E、360E、359E、345E、358E、351E、349E 和352E，低含量组的无性系有340E、348E、344E、790E。通过聚类分析法得到β-蒎烯高含量组的无性系有126E、361E、362E、614E、115E、116E 和120E；得到β-水芹烯高含量组的无性系有353E、344E、124E、790E、340E和342E；得到总单萜高含量组的无性系有353E、358E、356E、614E 和124E。

图2 α-蒎烯相对含量大小聚类分析树状图Fig.2 Dendrogram in cluster analysis of the relative content of α-pinene

根据聚类分析结果按相对含量大小将无性系分组后，对不同组别进行方差分析，得到的结果如图3 所示。由图3 可知，除去未进行方差分析的组别（β-蒎烯中含量组和单萜低含量组均只有一个无性系，故未做方差分析），α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯和单萜4 个组分中，高含量、中含量、低含量3 组之间的差异均显著，中含量组和平均值的差异均不显著。α-蒎烯高含量组的平均相对含量为33.158%，高出平均值30.605%；β-蒎烯高含量组的平均相对含量为11.148%，高出平均值187.913%；β-水芹烯高含量组的平均相对含量为23.768%，高出平均值57.990%；单萜高含量组的平均相对含量为53.312%，高出平均值15.366%。

3 讨论

关于加勒比松松脂组分的研究已有报道，如宋湛谦等[21]研究了对不同地理变种的加勒比松松脂化学组成，发现不同地理变种的加勒比松松脂化的特征基本上是一致的。吴东山等[22]对加勒比松、湿地松和杂交松松脂化学组分及松脂产量进行了对比分析。这些研究显示加勒比松松脂主要由单萜和二萜组成，其中相对含量最大的单萜和树脂酸分别是α-蒎烯和长叶松酸/左旋海松酸。这一研究结果与本研究中第1 类加勒比松松脂化学组成类似，但这些研究仅对松脂组分特征进行描述，未能根据松脂各组分的用途及需求进行有针对性的选育工作。松脂经过水蒸气蒸馏后可以分离出松节油和树脂酸，松节油经过单离后可以得到较高纯度的α-蒎烯、β-蒎烯等附加值较高的纯品。松脂原料中化合物组分数量及各组分的含量大小对于后续的深加工都有较大的影响。本研究在同一立地条件下分析不同加勒比松无性系的松脂组分及相对含量，分析归纳加勒比松松脂组成特点，筛选出了高含α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯和单萜组分的无性系材料各8、7、6 和5 份，可为松脂组分定性培育及松脂组分改良提供优质的亲本材料。松脂中高附加值组分含量越高，其经济价值越高，目前松节油价格日趋增加，因此有针对性地选育松脂中高含高附加值组分的加勒比松无性系可以满足不同行业对松脂原料的需求。

3-蒈烯是自然界中少数几种含有三元环结构的手性源化合物之一，在农药、医药、增塑剂及无感染性溶剂中发挥着不可代替的作用[23-26]。此前我国产脂松树中报道的松脂中3-蒈烯含量较高的仅有云南的思茅松[27-28]。此次在松脂中首次发现高含3-蒈烯组分的加勒比松无性系，可为3-蒈烯的应用提供原料保障。

本研究从无性系水平对加勒比松松脂组分进行分析，并筛选出部分高含高附加值组分的无性系材料，下一步将在此基础上对加勒比松子代松脂组分进行研究，分析松脂组分（特别是高含量组分及高附加值组分）的遗传特性。

4 结论

本研究首次发现松脂中高含3-蒈烯组分的3 个加勒比松无性系。第1 类加勒比松无性系松脂中α-蒎烯相对含量显著高于第2 类，但两类松脂中总的单萜含量差异不显著。筛选出的松脂中高含α-蒎烯的无性系有356E、360E、359E、345E、358E、351E、349E 和352E，高含β-蒎烯的无性系有126E、361E、362E、614E、115E、116E 和120E；高含β-水芹烯的无性系有353E、344E、124E、790E、340E 和342E；高含单萜的无性系有353E、358E、356E、614E 和124E。筛选出的高含组分无性系松脂中，高含组分的相对含量均显著高于其对应的平均值，可通过无性系造林和杂交育种提高目标组分的含量，对于松脂原料品质的提升具有一定的研究和应用价值，对松脂组分定向培育和松脂组分改良有较好的指导意义。