常春藤皂苷元通过调控lncRNA PCAT19/miR-4319对TPC-1甲状腺癌细胞生物学行为的影响

郑 奕， 闫乐玉， 陈 艳， 徐小波*

(1.黄淮学院医学院，河南 驻马店 463000；2.黄淮学院化学与制药工程学院，河南 驻马店 463000；3.黄淮学院建筑工程学院，河南 驻马店 463000)

常春藤皂苷元是从藤梨根、威灵仙等植物中提取的一种齐墩果烷型单萜类化合物，具有抗肿瘤等作用，可抑制宫颈癌细胞增殖[1]。在喉癌细胞中，lncRNA PCAT19呈高表达，并可通过调节miR-182/PDK4促进细胞增殖[2]。靶基因预测软件LncBase预测显示，PCAT19与miR-4319有结合位点，并且后者在甲状腺癌细胞中呈低表达，上调其表达可抑制甲状腺癌细胞增殖及转移[3]，但PCAT19/miR-4319对甲状腺癌细胞的调控机制尚不明确。因此，本研究探讨常春藤皂苷元是否通过调控PCAT19/miR-4319表达影响甲状腺癌细胞生物学行为，以期为甲状腺癌治疗药物的研发提供新方向。

1 材料

1.1 细胞 甲状腺癌TPC-1细胞，购自通派(上海)生物科技有限公司。

1.2 试剂与药物 常春藤皂苷元(纯度>98%)购自成都曼思特生物科技有限公司，溶于DMSO中备用。DMEM培养基、胎牛血清、MTT试剂、BeyoRTTMⅢ cDNA合成试剂盒、BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix均购自上海碧云天生物技术有限公司；Lipofectamine2000、Trizol试剂、pcDNA均购自美国Invitrogen公司；miR-4319模拟物(miR-4319 mimics)、mimic NC序列(miR-NC)、PCAT19干扰RNA(si-PCAT19)、阴性对照(si-NC)均购自广州市锐博生物科技有限公司；PCAT19过表达(pcDNA-PCAT19)购自吉满生物科技(上海)有限公司；Matrigel购自美国BD公司；Transwell购自美国Corning公司；兔抗人Twist、Snail、N-cadherin、E-cadherin抗体和二抗均购自美国Santa Cruz公司。

1.3 仪器 Nanodrop2000c超微量分光光度计、Multiskan Sky 酶标仪均购自美国Thermo Fisher公司；StepOnePlus实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；CytoFLEX流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司；CO2培养箱购自济南来宝医疗器械有限公司；电泳仪购自北京六一生物科技有限公司。

2 方法

2.1 细胞转染、分组及给药 取对数期TPC-1细胞接种于96孔板，用5、10、20 μg/mL常春藤皂苷元培养24 h[4]，分别作为常春藤皂苷元低、中、高剂量组，将正常培养的细胞作为对照组。si-NC、si-PCAT19转染TPC-1细胞，6 h后将培养基更换为含有10%胎牛血清的完全培养基培养24 h，分别作为si-NC组、si-PCAT19组。pcDNA、pcDNA-PCAT19分别转染至TPC-1细胞，6 h后将培养基更换为含有20 μg/mL常春藤皂苷元的培养基培养24 h，分别作为pcDNA组、pcDNA-PCAT19组。

2.2 MTT检测细胞增殖 各组TPC-1细胞接种于96孔板，每孔加20 μL MTT溶液培养4 h，弃上清，加150 μL DMSO，用酶标仪检测490 nm波长处光密度(OD)值。

2.3 流式细胞术检测细胞周期 各组TPC-1细胞制成单细胞悬液(1×104/mL)，将细胞收集于流式管中，离心5 min后弃上清，加入300 μL含10%胎牛血清的培养基重悬细胞，再加入700 μL无水乙醇，置于-20 ℃冰箱中固定24 h，1 572×g离心30 s后弃上清，PBS洗涤后加入400 μL PI染色液染色10 min，采用流式细胞仪检测细胞周期占比。

2.4 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭能力 在上室中加40 μL Matrigel稀释液，加入含有TPC-1细胞(1×104个)、不含血清的培养基200 μL，下室加500 μL含有胎牛血清的培养基，培养24 h后多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色30 min，在显微镜下拍照并计数细胞。在迁移实验操作过程中，小室的上室不加入Matrigel基质胶。

2.5 RT-qPCR检测PCAT19、miR-4319 mRNA表达 采用TRIzol试剂提取各组TPC-1细胞总RNA，按照BeyoRTTMⅢ cDNA合成试剂盒说明书操作反转录合成cDNA，进行RT-qPCR反应，按照BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix 说明书配制反应体系，采用2-ΔΔCT法检测目的基因相对表达。

2.6 双荧光素酶报告基因检测PCAT19、miR-4319的靶向关系 将PCAT19野生型/突变型(WT/MUT)克隆至pmirGLO载体中，分别将miR-NC、miR-4319 mimics、WT-PCAT19、MUT-PCAT19转染至TPC-1细胞，24 h后用双荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活性。脂质体转染技术将pcDNA、pcDNA-PCAT19、si-NC、si-PCAT19转染至TPC-1细胞，24 h后用RT-qPCR法检测miR-4319的表达。

2.7 Western blot检测Twist、Snail、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达 收集各组TPC-1细胞，加入裂解液裂解细胞，100 ℃水浴10 min，13 700×g离心10 min，取上清，即得总蛋白，检测其浓度。配制12%分离胶与浓缩胶，电泳分离蛋白，转膜，封闭2 h，加入Twist(1∶1 000)、Snail(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)一抗和内参GAPDH抗体(1∶2 000)稀释液，在4 ℃下孵育过夜，加二抗稀释液(1∶10 000)室温孵育1 h，采用Image J软件分析各条带灰度值。

3 结果

3.1 常春藤皂苷元对TPC-1细胞增殖及周期的影响 与对照组比较，常春藤皂苷元各剂量组细胞存活率、S期细胞比例降低(P<0.05)，G0/G1期细胞比例升高(P<0.05)，并呈剂量依赖性，见表1。

表1 常春藤皂苷元对TPC-1细胞增殖及细胞周期的影响

3.2 常春藤皂苷元对TPC-1细胞迁移及侵袭能力的影响 与对照组比较，常春藤皂苷元各剂量组迁移及侵袭细胞数减少(P<0.05)，Twist、Snail、N-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)，并呈剂量依赖性，见图1、表2。

3.3 常春藤皂苷元对TPC-1细胞中lncRNAPCAT19、miR-4319表达的影响 与对照组比较，常春藤皂苷元各剂量组PCAT19表达降低(P<0.05)，miR-4319表达升高(P<0.05)，并呈剂量依赖性，见表3。

3.4PCAT19与miR-4319的靶向关系 LncBase预测显示，PCAT19与miR-4319存在结合位点，见图2A。与miR-NC组比较，过表达miR-4319降低WT-PCAT19荧光素酶活性(P<0.05)，见图2B。PCAT19可负向调控miR-4319表达，见图2C。

表2 常春藤皂苷元对TPC-1细胞迁移及侵袭的影响

表3 常春藤皂苷元对TPC-1细胞中lncRNA PCAT19、miR-4319表达的影响

3.5 抑制PCAT19表达对TPC-1细胞增殖、细胞周期、迁移及侵袭能力的影响 与si-NC组比较，si-PCAT19组细胞存活率、S期细胞比例、迁移及侵袭细胞数降低(P<0.05)，G0/G1期细胞比例、E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)，Twist、Snail、N-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)；2组间G2/M期细胞比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3、表4。

3.6 上调PCAT19表达可逆转常春藤皂苷元对TPC-1细胞增殖、细胞周期、迁移及侵袭的作用 与pcDNA组比较，pcDNA-PCAT19组miR-4319表达降低(P<0.05)，细胞存活率升高(P<0.05)，G0/G1期细胞比例降低(P<0.05)，S期细胞比例升高(P<0.05)，迁移及侵袭细胞数增多(P<0.05)，Twist、Snail、N-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)，见图4、表5。

表4 抑制PCAT19表达对TPC-1细胞增殖、细胞周期、迁移及侵袭的影响

表5 上调PCAT19表达逆转常春藤皂苷元对TPC-1细胞增殖、细胞周期、迁移及侵袭的作用

4 讨论

甲状腺癌细胞的高度转移能力导致患者预后较差，且患者生存期缩短，越来越多的研究表明部分中药可减缓甲状腺癌的发展进程，其可通过多途径或调控多个靶点而达到治疗目的[5-6]。lncRNA在甲状腺癌中表达上调或下调，并可能发挥癌基因或抑癌基因作用，当癌基因活化或抑癌基因失活时均可能促进甲状腺癌的发生发展，通过调控lncRNA表达可逆转甲状腺癌细胞生物学行为进而抑制其发生发展[7-8]。

常春藤皂苷元可抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭及诱导细胞凋亡[9]。常春藤皂苷元可能通过抑制PI3K/Akt信号通路，从而抑制前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭，并可促进细胞凋亡[10]。常春藤皂苷元还可通过抑制顺铂耐药性头颈癌细胞凋亡，从而增强其对顺铂的敏感性[11]。但常春藤皂苷元对甲状腺癌的研究尚未见报道。本研究发现，常春藤皂苷元以剂量依赖性地降低甲状腺癌细胞存活率，并可诱导G0/G1期细胞比例升高，而降低S期细胞比例，提示常春藤皂苷元可通过诱导细胞周期阻滞于G0/G1期而抑制甲状腺癌细胞增殖。转录因子Twist、Snail与细胞迁移调控相关，是调控上皮-间质转化(EMT)的重要转录因子，EMT主要是指在某些条件下，具有极性的上皮细胞失去极性转化成间充质细胞，从而促使迁移及侵袭发生，Twist、Snail、N-cadherin表达增加，E-cadherin表达降低可促进EMT发生及肿瘤转移[12]。本研究结果显示，常春藤皂苷元处理后甲状腺癌迁移及侵袭细胞数减少，Twist、Snail、N-cadherin蛋白表达降低，E-cadherin蛋白表达升高，提示常春藤皂苷元可抑制甲状腺癌细胞迁移及侵袭，但常春藤皂苷元调控甲状腺癌细胞生物学行为的分子机制尚需进一步探究。

本研究发现，不同剂量常春藤皂苷元处理后甲状腺癌细胞中PCAT19表达降低，miR-4319表达升高。研究表明抑制PCAT19表达可抑制神经胶质瘤细胞增殖及侵袭[13]，沉默PCAT19可抑制非小细胞肺癌细胞增殖[14]。本研究结果显示，抑制PCAT19表达可降低甲状腺癌细胞存活率，诱导细胞周期阻滞于G0/G1期，还可抑制细胞迁移及侵袭，提示PCAT19高表达可通过调控细胞生物学行为而促进甲状腺癌的发生发展。本研究进一步证实PCAT19可靶向结合miR-4319。研究表明miR-4319可通过靶向ABTB1而抑制结直肠癌细胞增殖及诱导细胞周期阻滞[15]。在食管鳞状细胞癌细胞[16]、乳腺癌[17]中miR-4319表达下调，上调miR-4319表达能抑制细胞增殖、转移。本研究显示，上调PCAT19表达可通过抑制miR-4319表达而逆转常春藤皂苷元对甲状腺癌细胞生物学行为的作用，提示PCAT19/miR-4319可能介导常春藤皂苷元调控甲状腺癌细胞生物学行为过程。

综上所述，常春藤皂苷元可诱导细胞周期阻滞于G0/G1期，抑制甲状腺癌细胞增殖、迁移、侵袭，其作用机制与抑制PCAT19表达及促进miR-4319表达有关。