红花化学成分及其抑制子宫平滑肌收缩作用

赵 芮， 李馨蕊， 李 雷， 彭 成， 刘 娟*， 熊 亮*

(1.成都中医药大学药学院，省部共建西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137；2.成都中医药大学西南特色药材创新药物成分研究所，四川 成都 611137)

红花CarthamustinctoriusL.是菊科红花属植物，又名红蓝花、刺红花等，始载于《新修本草》，主要药用部位为其干燥管状花[1]，我国产区主要为四川、新疆、河南、甘肃、云南等地[2]，其性温，味辛，归心、肝经，具有活血通经、祛瘀止痛之功效[3]，临床上用于治疗原发性痛经[4]、心脑血管疾病等，目前相关研究主要集中于化学成分分离鉴定及药理活性研究[5]，国内外学者从中分离鉴定出近200个化合物，包括黄酮、生物碱、聚炔、木脂素、萜类、苯丙素等[6]。现代药理研究表明，红花具有保护脑组织、抗血栓、抗炎、抗肿瘤、保肝，镇痛等多种生理活性[6-7]，但目前关于该植物抑制子宫平滑肌收缩的研究还较少，药效物质基础尚不明确。因此，本实验采用现代色谱分离技术对红花水煎液化学成分进行研究，并考察所得化合物对大鼠离体子宫平滑肌收缩活动的影响，以期为该植物治疗痛经提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Rotavapor R-205旋转蒸发仪、Gradient Former B-687中压液相色谱仪(瑞士Buchi公司)；半制备型C18色谱柱(250 mm×10 mm，5 μm)、制备型C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，4 μm)、Micro TOF-Q Ⅱ型质谱仪(美国Agilent公司)；Avance Neo 600 MHz核磁共振波谱仪、Avance Neo 700 MHz核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)；Milli Q超纯水仪(美国Millipore公司)；Powerlab多功能生理记录仪、恒温水浴槽、Labchart Pro专业版软件(澳大利亚埃德公司)；DZKW-S-4电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)。

高效薄层硅胶GF254(烟台江友硅胶开发有限公司)；柱色谱硅胶H(200～300目，青岛海洋化工厂)；D101大孔吸附树脂(成都科龙化工试剂厂)；Sephadex LH-20、葡聚糖凝胶Sephadex HW-40F(瑞典Amershan Pharmacia公司)。缩宫素注射液(江西省创欣药业基团有限公司，批号20191011)；戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司广州分公司，批号401A，规格1 mg/片)；盐酸维拉帕米(中国食品药品检定研究院，批号100223-200102)。甲醇、乙腈为色谱纯(美国Sigma公司)；其余试剂均为分析纯。

1.2 药材 红花于2018年6月采自四川省巴中市平昌县石垭乡锣乐村，经成都中医药大学药学院高继海副教授鉴定为菊科红花属植物红花CarthamustinctoriusL.的干燥花，标本(CT-20180608)保存于成都中医药大学西南特色药材创新药物成分研究所。

1.3 动物 健康成年未孕SD大鼠，普通级，体质量220～250 g，由成都达硕实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(川)2020-030。

2 提取与分离

取干燥红花50 kg，加水煎煮2次，每次1 h，药液合并浓缩，得水提物16 kg，加水溶解分散后经D101大孔吸附树脂富集，分别用纯水、20%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇梯度洗脱，回收溶剂得到5个洗脱部分。70%乙醇洗脱部分经硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇(1∶0～0∶1)洗脱得到14个流分(Fr.1～Fr.14)，Fr.3依次经硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇100∶1～0∶1)、Sephadex HW-40F柱色谱(甲醇)、反相半制备高效液相色谱(50%甲醇)，得到化合物1(3.5 mg)。Fr.7经反相中压液相色谱，20%～100%甲醇梯度洗脱，得到10个流分(Fr.7-1～Fr.7-10)，Fr.7-3经硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇50∶1～1∶1)洗脱得到4个流分(Fr.7-3-1～Fr.7-3-4)，Fr.7-3-1经Sephadex HW-40F(50%甲醇)洗脱得到14个流分(Fr.7-3-1-1～Fr.7-3-1-14)，Fr.7-3-1-10经制备薄层色谱(二氯甲烷-甲醇12∶1)、反相半制备高效液相色谱(50%甲醇)得到化合物3(1 mg)、4(1 mg)，Fr.7-3-3经制备薄层色谱(石油醚-丙酮1.5∶1)、反相半制备高效液相色谱(60%甲醇)得到化合物2(1.5 mg)；Fr.7-5经Sephadex LH-20柱色谱(60%甲醇)得到3个流分(Fr.7-5-1～Fr.7-5-3)，Fr.7-5-1再经制备薄层色谱(石油醚-丙酮1.2∶1)、反相半制备高效液相色谱(45%甲醇)得到化合物5(3.1 mg)，Fr.7-5-3经硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇50∶1～1∶1)梯度洗脱得到6个流分(Fr.7-5-3-1～ Fr.7-5-3-6)，Fr.7-5-3-5经反相半制备高效液相色谱(37%乙腈)得到化合物6(3.3 mg)；Fr.7-7经Sephadex LH-20柱色谱(60%甲醇)得到4个流分(Fr.7-7-1～Fr.7-7-4)，Fr.7-7-1经制备薄层色谱(石油醚-丙酮1∶1)、反相半制备高效液相色谱(45%甲醇)得到化合物7(2.0 mg)；Fr.7-7-4依次经制备薄层色谱(石油醚-丙酮1∶1)、反相半制备高效液相色谱(45%甲醇)得到化合物8(4.0 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末，易溶于甲醇；HR-ESI-MSm/z：606.257 8[M+Na]+(C34H37N3O6Na)。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)，δ：7.53(1H，d，J=16.2 Hz，H-7″)，7.48(1H，d，J=16.2 Hz，H-7‴)，7.45(1H，d，J=16.2 Hz，H-7′)，7.43(2H，d，J=8.4 Hz，H-2″，6″)，7.39(2H，d，J=8.4 Hz，H-2‴, 6‴)，7.36(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′, 6′)，6.79(2H，d，J=8.4 Hz，H-3‴，5‴)，6.77(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，6.73～6.77(2H，d，J=8.4 Hz，H-3″，5″)，6.79 (1H，d，J=16.2 Hz，H-8″)，6.42(1H，d，J=16.2 Hz，H-8‴)，6.41 (1H，d，J=16.2 Hz，H-8′)，3.52(4H，m，H2-4，6)，3.35(4H，m，H2-2，9)，1.93(1H，m，H-3a)，1.86(1H，m，H-3b)，1.70(2H，m，H2-7)，1.61(2H，m，H2-8)；13C-NMR(150 MHz，CD3OD)δ：169.2(C-9′，9‴)，169.1/169.4(C-9″)，160.6/160.7(C-4′，4″，4‴)，144.4(C-7″)，141.8/141.9/142.2(C-7′，7‴)，130.9(C-2″，6″)，130.6(C-2′，6′，2‴，6‴)，127.8(C-1″)，127.6(C-1′，1‴)，118.4(C-8‴)，118.1/118.3(C-8′)，116.8(C-3′，3″，3‴，5′，5″，5‴)，114.8(C-8″)，47.6/49.0(C-6)，45.7/47.0(C-4)，39.9/40.1(C-9)，37.9/38.2(C-2)，28.9/30.6(C-3)，27.9/28.0(C-8)，26.3/27.9(C-7)。与文献[8]报道基本一致，故鉴定为N1，N5，N10-tri-p-coumaroylspermidine。

化合物2：无色油状物，易溶于甲醇；HR-ESI-MSm/z：215.068 2[M+Na]+(C11H12O3Na)。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.58(1H，d，J=16.2 Hz，H-7)，7.38(2H，d，J=9.0 Hz，H-2，6)，6.71(2H，d，J=9.0 Hz，H-3，5)，6.21(1H，d，J=16.2 Hz，H-8)，4.20(2H，q，J=7.2 Hz，H2-1′)，1.31(3H，t，J=7.2 Hz，H3-2′)；13C-NMR(150 MHz，CD3OD)δ：169.8(C-9)，159.5(C-4)，147.1(C-7)，131.3(C-2，C-6)，124.9(C-1)，118.2(C-3，C-5)，113.2(C-8)，61.3(C-1′)，14.7(C-2′)。与文献[9]报道基本一致，故鉴定为4-乙氧基桂皮酸。

化合物3：无色针晶，易溶于甲醇；HR-ESI-MSm/z：215.068 1[M+Na]+(C11H12O3Na)。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.60(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.85(1H，d，J=12.6 Hz，H-7)，6.74(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，5.75(1H，d，J=12.6 Hz，H-8)，4.16(2H，q，J=7.2 Hz，H2-1′)，1.26(3H，t，J=7.2 Hz，H3-2′)；13C-NMR(150 MHz，CD3OD)δ：165.8(C-9)，160.5(C-4)，144.7(C-7)，133.5(C-2，6)，126.6(C-1)，115.8(C-8)，115.3(C-3，5)，61.2(C-1′)，14.5(C-2′)。与文献[10]报道基本一致，故鉴定为顺式对羟基肉桂酸乙酯。

化合物4：无色晶体，易溶于甲醇；HR-ESI-MSm/z：215.068 1[M+Na]+(C11H12O3Na)。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.60(1H，d，J=15.6 Hz，H-7)，7.45(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.80(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，6.31(1H，d，J=15.6 Hz，H-8)，4.22(2H，q，J=7.2 Hz，H2-1′)，1.31(3H，t，J=7.2 Hz，H3-2′)；13C-NMR(150 MHz，CD3OD)δ：169.4(C-9)，161.4(C-4)，146.4(C-7)，131.1(C-2，6)，127.1(C-1)，116.8(C-8)，115.3(C-3，5)，61.4(C-1′)，14.6(C-2′)。与文献[11]报道基本一致，故鉴定为反式对羟基肉桂酸乙酯。

化合物5：无色晶体，易溶于甲醇；HR-ESI-MSm/z：319.151 8[M+Na]+(C16H24O5Na)。1H-NMR(700 MHz，CD3OD)δ：8.01(1H，d，J=16.1 Hz，H-8)，6.55(1H，d，J=16.1 Hz，H-7)，5.78(1H，brs，H-10)，4.12(1H，m，H-3)，3.82(1H，dd，J=7.0，2.8 Hz，H-12a)，3.72(1H，d，J=7.0 Hz，H-12b)，3.70(3H，s，OCH3-11)，2.09(3H，brs，H3-15)，2.04(1H，dd，J=14.0，7.0 Hz，H-4a)，1.86(1H，dd，J=14.0，7.0 Hz，H-4b)，1.73(1H，dd，J=14.0，10.5 Hz，H-2a)，1.66(1H，m，H-2b)，1.15(3H，s，H3-14)，0.94(3H，s，H3-13)；13C-NMR(175 MHz，CD3OD)δ：168.1(C-11)，152.0(C-9)，135.7(C-7)，131.7(C-8)，118.3(C-10)，87.8(C-5)，83.2(C-6)，77.3(C-12)，66.0(C-3)，51.6(OCH3-11)，49.5(C-1)，46.0(C-4)，44.5(C-2)，21.2(C-15)，19.6(C-14)，16.4(C-13)。与文献[12]报道基本一致，故鉴定为(-)-methyl dihydrophaseate。

化合物6：无色晶体，易溶于甲醇；HR-ESI-MSm/z：277.177 5[M+Na]+(C15H26O3Na)。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：5.20(1H，d，J=1.8 Hz，H-15a)，4.71(1H，d，J=1.8 Hz，H-15b)，3.73(1H，d，J=9.0 Hz，H-3)，3.49(1H，ddd，J=11.4，9.0，5.4 Hz，H-2)，1.78(1H，d，J=12.0 Hz，H-5)，1.74(1H，dd，J=12.6，4.8Hz，H-1a)，1.71(1H，m，H-8a)，1.64(1H，m，H-6a)，1.60(1H，dt，J=12.6，3.0Hz，H-9a)，1.38(1H，m，H-7)，1.32(1H，m，H-6b)，1.28(1H，m，H-1b)，1.26(1H，m，H-9b)，1.21(1H，m，H-8b)，1.18(3H，s，H3-12)，1.18(3H，s，H3-13)，0.73(3H，s，H3-14)；13C-NMR(150 MHz，CD3OD)δ：151.8(C-4)，105.3(C-15)，79.7(C-3)，73.8(C-2)，73.3 (C-11)，50.4(C-7)，49.3(C-1)，49.1(C-5)，41.7(C-9)，35.9(C-10)，27.4(C-13)，26.8(C-12)，26.1(C-8)，23.1(C-6)，17.7(C-14)。与文献[13]报道基本一致，故鉴定为plucheol A。

化合物7：无色胶状物，易溶于甲醇；HR-ESI-MSm/z：336.120 2[M+Na]+(C18H19NO4Na)。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.36(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，7.00(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.93(1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-6′)，6.74(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.69(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，6.61(1H，d，J=12.6 Hz，H-7′)，5.81(1H，d，J=12.6 Hz，H-8′)，3.83(3H，s，OCH3-3′)，3.40(2H，t，J=7.2 Hz，H2-8)，2.69(2H，t，J=7.2 Hz，H2-7)；13C-NMR(150 MHz，CD3OD)δ：170.4(C-9′)，156.9(C-4)，148.6(C-4′)，148.5(C-3′)，138.4(C-7′)，131.2(C-1)，130.7(C-2，6)，128.5(C-1′)，124.8(C-6′)，121.6(C-8′)，116.3(C-3，5)，115.8(C-5′)，113.9(C-2′)，56.4(OCH3-3′)，42.4(C-8)，35.6(C-7)。与文献[14]报道基本一致，故鉴定为N-顺式-阿魏酰酪胺。

化合物8：白色粉末，易溶于甲醇；HR-ESI-MSm/z：337.162 5[M+Na]+(C16H26O6Na)。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：5.58(1H，m，H-3)，4.27(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′)，4.16(1H，d，J=12.6 Hz，H-10a)，4.07(1H，d，J=12.6 Hz，H-10b)，3.86(1H，dd，J=12.0，1.8 Hz，H-6′a)，3.67(1H，dd，J=12.0，6.0 Hz，H-6′b)，3.34(1H，t，J=9.0 Hz，H-3′)，3.28(1H，t，J=9.0 Hz，H-4′)，3.22(1H，m，H-5′)，3.19(1H，m，H-2′)，2.43(1H，dt，J=8.4，5.4 Hz，H-6a)，2.29(2H，m，H2-4)，2.24(1H，m，H-1)，2.09(1H，m，H-5)，1.31(3H，s，H3-8)，1.20(1H，d，J= 8.4 Hz，H-6b)，0.85(3H，s，H3-9)；13C-NMR(150 MHz，CD3OD)δ：146.1(C-2)，121.6(C-3)，102.7(C-1′)，78.2(C-5′)，78.0(C-3′)，75.1(C-2′)，72.5(C-10)，71.7(C-4′)，62.8(C-6′)，44.5(C-1)，42.1(C-5)，38.9(C-7)，32.4(C-6)，32.3(C-4)，26.7(C-8)，21.4(C-9)。与文献[15]报道基本一致，故鉴定为桃金娘苷。

4 抑制子宫平滑肌舒张活性研究

大鼠灌胃给予戊酸雌二醇溶液8 mg/kg，连续2 d，以提高子宫对药物的敏感性。第3天，颈椎脱臼处死大鼠，迅速剖取子宫，快速置于盛有洛氏液的玻璃皿中，剔除肌条上脂肪，剪除周围组织，取中间段子宫平滑肌2～3 cm，将肌条一端固定于盛有20 mL洛氏液的恒温水浴槽中[16](持续通入95%O2、5%CO2，每秒1～2个小气泡)，另一端连接张力换能器，将静息张力调节为1 g，采用PowerLab多功能生理记录仪记录子宫收缩曲线。采用160 μL缩宫素建立大鼠子宫平滑肌收缩模型，以100 μL DMSO为溶剂对照，4×10-6mol/L盐酸维拉帕米为阳性对照，给药组终浓度分别为1、10、50 μmol/L，给药后观察10 min内离体子宫平滑肌的收缩张力及收缩活力(收缩张力平均值×收缩频率，其中收缩频率为10 min内子宫平滑肌收缩次数)，记录收缩曲线，计算给药后收缩活力抑制率和收缩张力抑制率。每次药物作用后用洛氏液冲洗子宫肌条3次，待其收缩稳定后再进行其他实验，重复3次[17]。

如图1所示，与正常组比较，加入160 μL缩宫素后大鼠子宫平滑肌收缩活动显著提高；DMSO对子宫平滑肌收缩活动无明显影响，而盐酸维拉帕米和不同浓度化合物对其具有一定抑制作用。如表1、图2所示，与溶剂对照组比较，阳性对照组大鼠子宫平滑肌收缩活力抑制率、收缩张力抑制率升高(P<0.01)；化合物1、7中、高剂量组收缩张力抑制率升高(P<0.05，P<0.01)，而两者各剂量组收缩活力抑制率无显著差异(P>0.05)。

表1 化合物1、7对子宫平滑肌收缩活动的影响

5 讨论

红花为传统的川产活血化瘀中药，药用历史悠久，对治疗妇科疾病具有显著疗效[18]，其活血通经作用一直为研究热点[19]。本实验采用现代分离手段和波谱学技术，从红花中分离鉴定了8个化合物1～8，其中1、7为生物碱，5、6、8为萜类，2～4为苯丙素类，丰富了对该植物化学成分的认识。另外，中高剂量化合物1、7均能抑制大鼠子宫平滑肌收缩张力，并呈现剂量依赖性。