布鲁氏菌生物恐怖战剂RTqPCR现场检测方法研究

张立安,宗 鹏，任小侠，侯亚欣，王 楠，王慧飞

1.烟台市消防救援支队，山东 烟台 264000； 2.抚州市消防救援支队，江西 抚州 344000； 3.中国兽医药品监察所，北京 100081； 4.中国人民警察大学 a.研究生院； b.侦查学院，河北 廊坊 065000

0 引言

生物恐怖袭击是指利用细菌、病毒和毒素等生物制剂作为武器针对人类、动物和农作物实施攻击，造成伤亡、制造恐慌的一种恐怖主义形式。布鲁氏菌作为失能型生物恐怖战剂，可以感染人和牲畜导致布鲁氏菌病[1-3]。根据《中华人民共和国传染病防治法》，布鲁氏菌病为乙类传染病[4]，世界卫生组织将其列为B类法定传染病[5]。根据疾病预防控制局的资料显示，2018年我国布鲁氏菌发病人数为37 947人，截止到2019年11月，2019年发病人数达43 635人。2010年东北农业大学27名学生和1名教师感染了布鲁氏菌病，2019年12月兰州兽医研究所发现96人感染布鲁氏菌病。布鲁氏菌病原体可通过体表皮肤黏膜、消化道、呼吸道侵入机体，人类患病的途径多样，包括食用未经高温消毒的牛奶和奶制品，直接接触受感染的动物组织，误食、吸入或注射培养的布鲁氏菌等[6]。布鲁氏菌病会造成严重的并发症甚至有死亡危险，因此快速精准检测布鲁氏菌、及时进行应急处置显得尤为重要。

自2000年以来，人类布鲁氏菌病是发病数上升速度最快的传染病之一[7-8]，而且布鲁氏菌病具有潜伏期，临床分为急性、亚急性、慢性三类，急性潜伏期在3个月以内，慢性潜伏期可达6个月[9]。因此，及时准确侦检是应对布鲁氏菌生物恐怖袭击的有效措施。目前血培养检测布鲁氏菌病是金标准[10-11]，我国现行《布鲁氏菌病诊断标准》(WS 269—2019)规定SAT和分离布鲁氏菌均为检测方法。布鲁氏菌传统血清学方法检测的特异性不强，且检测结果受检测人员主观意识影响较大。细菌分离培养技术检测时间较长，检测对试验环境、设备及操作人员要求较高，不适合现场检测。现场试纸检测受检测时机限制及环境温度等影响，其灵敏度检出限还有待技术完善和提高。分子生物学鉴定是近几年逐步发展的技术，具有特异高效的优点，在布鲁氏菌基因检测方面利用核糖体RNA、Omp25、IS711、BCSP31等保守序列做了大量研究和方法构建。实时荧光定量PCR(RTqPCR)方法具有灵敏性高、特异性好等特点，在实验室研究中应用广泛，反恐应急等部门也做了大量尝试和探索[12-14]。1990年，Fekete等开创了布鲁氏菌PCR检测先河，并利用多重PCR进行基因分型[15-17]。本文探讨适合现场快速检测布鲁氏菌的PCR方法，以期提高应急处突检测能力。

1 材料与方法

1.1 试验材料及仪器

试验材料：布鲁氏菌灭活疫苗株(S2)，由中国兽医药品监察所惠赠；Sybr Green qPCR mix、Taq PCR MasterMix、细菌基因组DNA快速提取试剂盒均购自北京艾德莱(Aidlab)生物有限公司；D2000 DNA Ladder购自Biosharp公司；Petrifim 6406菌落测试片(3M公司)；布鲁氏菌基因的载体构建由中美泰和生物技术(北京)有限公司完成；其他试剂为国产分析纯试剂或其配制而成。主要仪器：LightCycler 1.5型实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)，MyCycler型PCR仪(美国Bio-rad公司)，JY600C型水平电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)，AlphaDigiDoc实时凝胶处理系统(美国Alpha Innotech公司)，MSC12型生物安全柜(美国Thermog公司)。

1.2 检测方法

1.2.1 生物信息学分析

利用NCBI公布的16S核糖体RNA基因序列，通过BLAST和DNAMAN 6.0对比分析，利用MEGA 6.06软件的邻接法进行系统进化树构建，分析基因相似性。用Primer Premier 5.0设计上下游引物，如表1所示，引物由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成。

表1 引物序列及参数

1.2.2 质粒的提取与鉴定

按照Aidlab高纯质粒小量快速提取试剂盒的操作步骤提取质粒，作为阳性标准品。利用普通PCR进行目的基因鉴定，20 μL反应体系，Taq PCR MasterMix(Aidlab)10 μL，上下游引物B16SF、B16SR各0.5 μL，底物1 μL，双蒸水8 μL。反应程序为：预变性94 ℃，3 min，1个循环；变性94 ℃，10 s；退火/延伸60 ℃，30 s，30个循环。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后成像鉴定。

1.2.3 荧光定量正交试验

选择退火时间、退火温度、引物量设计3水平3因素如表2所示的L9(34)正交试验。实时荧光定量PCR反应体系为20 μL：Sybr Green qPCR mix 10 μL，上下游引物qBSF1、qBSR2各nμL，底物1 μL，双蒸水8 μL。反应程序为：预变性94 ℃，3 min，1个循环；变性94 ℃，10 s；退火/延伸m℃，ks，40个循环；溶解曲线40～85 ℃，升温速率0.2 ℃·s-1。

表2 参数设置

1.2.4 灵敏度与特异性检测

以10倍梯度稀释得到浓度为10-1～10-7的稀释菌液，取100 μL喷涂在菌落测试片上，37 ℃恒温培养48 h，计数菌斑，计算菌液浓度。使用稀释浓度菌液，按照优化后的反应体系进行RTqPCR反应，Ct值和溶解曲线分析反应灵敏度和特异性。

1.2.5 环境样本测试

采集草坪里的积水和地表土壤样本，样本处理方法为：使用移液枪吸取1 mL采集样本到一个离心管中，3 000 rpm离心5 min，使用移液枪吸取上清液转入新离心管中，13 000 rpm离心30 s，吸取下层液体作为检测样品，进行RTqPCR检测分析。

2 结果与讨论

2.1 重组质粒的鉴定

通过NCBI获得羊、牛、猪等种类布鲁氏菌(Brucella_melitensis_16M、Brucella_abortus、Brucella_ovis、Brucella_suis)的16S rRNA基因序列，通过生物信息学分析，选取高度同源保守序列片段，PCR扩增琼脂糖凝胶电泳获得如图1所示结果，与预期相符，且不在其他位置产生扩增条带。测序对比分析为布鲁氏菌16S rRNA目标基因片段。

图1 PCR扩增凝胶鉴定结果

2.2 正交试验结果与分析

PCR反应过程以单链DNA为模板，在反应溶液中经过变性、退火、延伸、循环使目的基因得以迅速扩增，PCR反应体系主要有Mix、水、引物和样品模板。由于Mix为缓冲体系，具有一定缓冲能力，两步反应中退火过程是引物与模板结合复制的过程，直接影响PCR的反应效率，引物量是一个重要变量。退火温度和退火时间是影响RTqPCR反应的两个条件变量，通过这三个要素的3水平3因素L9(34)正交试验，结果如表3所示。在正交试验中极差R值越大，则表明该因素水平的改变对试验结果影响越大，结果显示引物量的R值为4.68，远大于退火时间的1.93和退火温度的1.62，反应中一般增加反应物浓度有利于反应的正向进行，因此引物量为主要影响因素。k值体现出各单因素对反应的影响。由图2(a)看出随着引物量不断增加，Ct值呈递减趋势，0.8 μL时最低，说明随着引物量的增加，反应进入指数反应越早，反应越快。但同时也要考虑成本等其他因素，PCR是一个典型的酶促反应，选择反应体系的最适温度显然有利于反应的进行。从图2(b)看出随着退火温度升高，Ct值呈现先增后降趋势，59 ℃时最低，60 ℃时最高，表明在59 ℃时更有利于反应的进行。图2(c)则随着退火时间的增加，Ct值先抑后扬，30 s时Ct值最低，说明退火时间过短和过长都不利反应的进行。因此，通过正交试验确定三个要素的最优反应条件为A3B1C2，最终确定的最优反应条件为：总反应体系为20 μL，包括Sybr Green qPCR mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，超纯水7.4 μL，引物1 μL；采用两步法预变性94 ℃持续5 min，变性94 ℃持续10 s，退火延伸59 ℃持续30 s；扩增40个循环，扩增阶段温度变化速率20 ℃·s-1，每次在退火结束后收集荧光信号；溶解阶段从40 ℃向85 ℃升温溶解，升温速率0.2 ℃·s-1，持续收集荧光信号。

表3 正交反应结果分析

2.3 实时荧光定量PCR灵敏度与特异性分析

2.3.1 菌落的确定

细菌在Petrifilm测试片上生长时，细胞代谢产物与上层指示剂氯化三苯基四氮唑(TTC)发生氧化还原反应，将指示剂还原成红色非溶解性产物三苯甲，从而使细菌着色，故测试片上红色菌落判断为菌落总数，测试片菌落计数适宜范围为25～250 CFU。若所有稀释度的平均菌落数均不在区间，则以最接近区间的平均菌落数乘以稀释倍数计算。将培养的菌液稀释10-1～10-7倍，喷涂于菌落测试膜片上，37 ℃恒温培养48 h，结果如图3所示，稀释10-5倍的菌液在菌落测试片上形成菌斑远超250个，稀释10-7倍的菌液在测试片上几乎看不到菌落，稀释10-6倍的菌液在测试片上形成菌斑平均为22个，其菌落数量处理如表4所示，原始菌落浓度为2.2×108CFU·mL-1。

(a)引物量

(b)退火温度

(c)退火时间

2.3.2 RTqPCR灵敏性分析

RTqPCR是利用荧光信号监测PCR过程，只要有荧光信号便可以监测出扩增过程。根据菌落计数，进行菌液浓度梯度实时荧光定量PCR检测，图4中1号样为阳性对照，2～6号样分别为菌液稀释10-3、10-4、10-5、10-6和10-7倍浓度，7号样为阴性对照。表5列出各组Ct值，随着稀释倍数的增加，Ct值不断增大，5号样本菌液稀释10-6倍时Ct值平均为25.3±0.057，6号样本菌液稀释10-7倍时Ct值平均为30.3±0.027。由于采用荧光染料法，实时荧光信号曲线的Ct值在30个循环后可能出现非特异性扩增，且菌液稀释10-7倍时菌落无法计数，因此RTqPCR检测的菌液浓度至少为220 CFU·mL-1。

图3 不同稀释倍数菌液测试片培养结果

表4 菌落计数统计表

表5 不同稀释浓度布鲁氏菌RTqPCR扩增Ct值

图4 不同稀释浓度布鲁氏菌RTqPCR反应

2.3.3 RTqPCR特异性分析

利用RTqPCR溶解曲线来检验扩增产物的单一性，理想的特异性PCR反应一对引物只生成一种产物，且溶解曲线峰值只有一个，图5(a)阳性样本和布鲁氏菌疫苗株S2反应迅速，很快进入指数反应阶段，呈现S形荧光扩增曲线，其Ct值分别为9.8和13.6；阴性对照和大肠杆菌检测结果均为一条平滑直线，均无荧光值增长。图5(b)显示在65 ℃附近，出现明显单一峰，没有出现双峰、叠峰、多峰等现象，说明RTqPCR反应没有出现引物二聚体和非特异性扩增。表明引物设计具有非常强的特异性，扩增产物单一，利用16S rRNA基因片段作为检测鉴定布鲁氏菌具有相当可靠性。

2.4 环境样本测试

通过采集室外草坪里的积水和土壤样本，样本处理后，进行RTqPCR检测，结果如图6所示，阳性对照产生特异性扩增，土壤样本和水体样本Ct值在30以内没有出现扩增信号，表明目标检测区域没有阳性样本存在。

图5 RTqPCR特异性检测图

3 结论

根据NCBI公布的16S核糖体RNA基因保守区域序列设计合成特异性引物，通过PCR反应进行目的基因的扩增，构建并鉴定重组质粒，优化反应条件和扩增体系。用于检测的特异性目的片段16S rDNA是一种常用的布鲁氏菌PCR检测目标，扩增片段在布鲁氏菌属DNA中高度保守，可以有效将布鲁氏菌与其他细菌分离，有利于荧光定量PCR检测的应用。检测样本经简单处理直接作为PCR检测底物，省去了核酸提取步骤，适用于从各种相态环境样本中快速筛选存在布鲁氏菌基因组DNA的样品。得到本方法用于样品检测的检测限为220 CFU·mL-1菌浓度，并且体系有助于反应快速进入指数反应，Ct值出现早，且表现出良好特异性。通过采集自然水样和土壤样本进行环境样本实际检测，结果表明该检测方法对布鲁氏菌具有特异性，环境中其他菌株不会对检测结果造成影响。可见，在执行生物恐怖袭击现场侦检任务时，基于实时荧光定量PCR技术的基因检测方法能对布鲁氏菌快速、准确识别，满足检测需求，为生物恐怖袭击现场快速检测布鲁氏菌提供一种实用检测手段。

图6 模拟检测荧光信号图