杞月茶对卵巢储备功能下降大鼠卵巢组织Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

肖慧，刘宇，朱英英，李军

卵巢储备功能下降(decreasing ovarian reserve，DOR)是指卵巢内存留的可募集的卵泡数量减少，卵巢产生卵子的能力减弱，卵母细胞质量下降，导致生育能力下降。卵巢功能减退临床表现为月经周期紊乱、闭经、潮热、失眠、不孕等症状。DOR没有统一的诊断标准，实验室检测中常以基础FSH水平升高但未达到绝经期的水平，AMH水平降低，窦卵泡计数减少为标准[1]。辅助生殖技术协会临床结果报告系统(SART CORS)称[2]，2004—2011年诊断为DOR的人数从19%增加到26%，而年龄在40岁以下的诊断人数增加了42%。DOR是一个复杂的临床现象，其病因不详，受年龄、遗传、自身免疫和环境因素的影响[3]。目前治愈较为困难，已成为妇科内分泌相关领域关注的难点及热点问题。

前期动物实验研究发现[4]，杞月茶能够改善DOR模型大鼠的性激素水平，并探索出药物的适宜浓度，本研究在此基础上，进一步研究杞月茶改善大鼠卵巢储备功能的机制，报道如下。

1 材料及方法

1.1 材料 (1)动物及分组：SPF级雌性SD大鼠24只[北京维通利华，动物许可证号: SCXK(京)2016- 0011]，6周龄，体质量190～210 g，动物伦理审查批号(21-23)。(2)试药试剂：1，4-乙烯基-1-环己烯二环氧化物(VCD，sigma BCBV1352),戊酸雌二醇片[补佳乐，拜尔医药保健有限公司广州分公司],杞月茶(枸杞子15 g，月季花10 g)免煎颗粒(北京康仁堂药业有限公司)。血清促卵泡激素(FSH)、雌二醇(E2)、抗苗勒管激素(AMH)酶联免疫试剂盒(BLUE GENE公司)、兔抗BCL-2抗体(Proteintech SJ08108)、小鼠BAX抗体(Proteintech SJ08109)。(3)仪器设备: 离心机(上海赵迪生物科技有限公司，型号AXTGL16M)、切片机(德国H93，型号RM2126)、石蜡包埋机(德国Leica EG1160)、显微镜(日本ECLIPSE LV100POL公司，型号50IPOL)、全自动酶标仪(美国BioTek公司，型号ELx800)、水浴锅(江苏金坛市荣华仪器公司，型号SHA-C)。

1.2 实验方法 2021年3—5月于北京中医药大学东直门医院中心实验室进行实验。大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、杞月茶组、补佳乐组，每组 6 只，屏障环境喂养。除空白组外，其余大鼠进行卵巢储备功能下降造模[5]：按VCD 160 mg/kg予大鼠腹腔注射，每日1次，连续给药5 d。大鼠卵巢储备功能下降模型造模成功判断标准：每日做阴道脱落细胞涂片，观察动情周期。腹腔注射结束1个动情周期后动情期紊乱者，认为造模成功。造模成功后，杞月茶组予杞月茶24 g/kg剂量灌胃，补佳乐组予补佳乐0.12 mg/kg灌胃，空白组及模型组正常饮食并予生理盐水3 ml/kg灌胃，各组均每天1次，连续灌胃4周，每周停止灌胃1 d[4]。模型组1只大鼠在实验第33天意外死亡。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 大鼠一般情况观察：记录大鼠体质量、双侧卵巢体质量指数、子宫体质量指数[6]、饮食活动情况，光镜下观察阴道上皮脱落细胞变化情况及动情周期变化。

1.3.2 性激素水平检测：大鼠最后1次给药后，禁食12 h，腹腔注射0.4%戊巴比妥 1 ml/100 g，大鼠麻醉后，75%酒精消毒腹部皮肤，打开腹腔，腹主动脉取血 4 ml，离心取血清，以酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清FSH、E2、AMH的含量。

1.3.3 卵巢形态学观察：选取大鼠右侧卵巢,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋、切片，HE染色，普通光学显微镜观察卵巢组织形态学变化。

1.3.4 卵巢颗粒细胞(granulosa cell，GC)凋亡因子Bcl-2、Bax免疫组化检测：各组随机选取3只大鼠右侧卵巢组织石蜡切片脱蜡，用PBS冲洗3次，3%H2O2室温孵育10 min，蒸馏水冲洗，滴加Fas、FasL单克隆抗体，37℃孵育1～2 h,PBS冲洗2 min×3次，分别滴加1∶1 000、1∶400稀释的一抗Bax、Bcl-2，37℃孵育1 h,PBS冲洗2 min×3次，滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃孵育30 min,PBS冲洗2 min×3次，DAB显色剂显色，自来水充分冲洗，苏木精复染、封片。免疫组化染色后，细胞质为棕色或深棕色为阳性标记。使用高倍显微镜随机选择5个视网膜视野用IPP 6.0 软件定量测量各个指标平均光密度(IOD)。

1.3.5 卵巢颗粒细胞Bcl-2/Bax蛋白印迹检测：蛋白印迹法检测卵巢颗粒细胞Bcl-2/Bax表达水平，取出左侧卵巢组织(-80℃冰箱保存)，取50 μg蛋白在冰浴条件下加入细胞裂解液提取总蛋白并测定浓度，待检测蛋白样品上样量为10 μl，打开电泳装置，浓缩胶恒压90 V，约120 min；分离胶恒压120 V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。湿转法转膜条件：300 mA恒流；0.45 μm孔径PVDF膜，转膜时间90 min。封闭：将膜完全浸没于5%BSA-TBST中，水平摇床孵育1 h。 加入稀释1∶10 000、1∶1 000的Bax及Bcl-2一抗, 4℃水平摇床孵育过夜，Beta actin作为内参。次日，TBST洗膜洗3次，每次10 min。加入1∶10 000稀释的二抗，室温孵育45 min。洗膜同上。ECL滴加到膜的蛋白面，反应3 min；胶片曝光显影2 min，定影。利用IPP 6.0软件定量测量平均光密度。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况比较 大鼠造模后出现躁动表现，阴道上皮脱落细胞处于动情间期,经干预后可见明显动情周期。各组间大鼠体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组比较，模型组卵巢体质量指数降低(P<0.05)；与模型组比较，杞月茶组、补佳乐组卵巢体质量指数升高(P<0.05),但杞月茶组与补佳乐组比较差异无统计学意义(P>0.05)；各组大鼠子宫体质量指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

（1）自新中国成立以来，我国已建立了相对完善的城市规划体系，各级建设管理机制也相对完善，部门之间分工较为明确与合理，但在村镇规划建设管理上，还存在一系列问题，各项规划建设制度也不够完善。但是在具体实施过程中，由于缺乏资金的保障与支持，因此，经常会出现规划落后、管理混乱的问题，个别农村地区还未建立专门的建设管理部门，由于村镇规划属于一项综合性、系统性的工程，实践过程中，对于各种硬件设施要求较高，如办公设施、车辆等等，一旦这些设施准备不齐全，便会为村镇规划建设管理工作带来诸多不便，个别村镇容易缺乏完善可行的管理机制，从而直接对工程建设质量产生影响，不利于农村经济的健康稳定发展。

2.2 各组大鼠血清性激素水平比较 与空白组比较，模型组血清FSH水平升高，AMH水平降低(P<0.05)；

表1 各组大鼠一般情况比较

与模型组比较，杞月茶组及补佳乐组血清FSH水平均降低，AMH水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)，但杞月茶组与补佳乐组比较差异无统计学意义(P>0.05)；各组血清E2水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清性激素水平比较

2.3 各组大鼠卵巢形态学比较 空白组可见较多原始卵泡及初次级卵泡，颗粒细胞多，未见明显闭锁卵泡；模型组大鼠卵巢可见少量初次级卵泡及少量原始卵泡，颗粒细胞较少，可见较多闭锁卵泡；杞月茶组及补佳乐组初次级卵泡及成熟卵泡较多，颗粒细胞及闭锁卵泡较模型组减少，见图1。

注：.原始卵泡；.初次级卵泡；.颗粒细胞；.闭锁卵泡

2.4 大鼠卵巢颗粒细胞中Bcl-2、Bax凋亡因子及其Bcl-2/Bax蛋白表达比较 卵巢颗粒细胞免疫组化中，各组Bax蛋白主要表达在颗粒层细胞、黄体及间质。与空白组比较，模型组Bax蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组比较，杞月茶组及补佳乐组Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)，而杞月茶组与补佳乐组比较差异无统计学意义(P>0.05)；Bcl-2蛋白主要表达在各级卵泡的细胞核中，其表达在各组间差异无统计学意义(P>0.05)，见图2、表3。为进一步明确Bcl-2及Bax蛋白在卵巢组织中的表达，同时进行了组织蛋白印迹检测，与空白组比较，模型组Bcl-2/Bax凋亡因子比值降低(P<0.05)；与模型组比较，杞月茶组及补佳乐组Bcl-2/Bax凋亡因子比值显著升高(P<0.05)，而杞月茶组与补佳乐组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图3、表3。

表3 各组大鼠卵巢组织细胞Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较

3 讨 论

在DOR的治疗上，西医主要采用激素替代疗法，但仅具有改善症状、促进月经来潮的作用，对于改善生育能力方面疗效有限。多项研究显示，中医在DOR的治疗中发挥着良好的作用。中医认为，该病在病机上多以肾精亏虚、天癸不足为其根本，并可伴有肝郁、脾虚、血瘀等证[7]。

图3 各组大鼠卵巢组织Bcl-2、Bax蛋白表达电泳图

郭志强认为,卵巢储备功能下降的病机是以肝肾阴虚为主，兼见脾肾阳虚、肝郁化火、心肾不交等[8]。其发生与现代女性的一些不良生活习惯有关。王云欢[9]通过对临床病例数据挖掘，分析出女性卵巢功能低下与性生活、情绪、锻炼及睡眠有密切关系，郭氏中药序贯疗法可有效改善患者月经、妊娠率、改良中医症状评分、卵巢直径等，临床疗效满意，并基于此提出滋补肝肾、养血柔肝的治疗方法。实验采用郭志强临床常用滋肾养肝法的君臣药——“枸杞子”和“月季花”制备代茶饮“杞月茶”，具有补肾填精养血、柔肝疏肝、理气活血的作用，可从根本上调理肝肾，刺激卵巢发育和卵泡生长，在缓解症状的同时提高一定的生育能力[4]。

颗粒细胞(GC)的增殖、凋亡及激素分泌与卵泡的发育、卵母细胞的成熟密切相关。已有研究表明，Bcl-2家族成员在调节卵巢细胞凋亡、决定卵巢颗粒细胞和卵泡寿命等方面发挥重要作用[10-12]。其中，Bcl-2是一种抑制细胞凋亡、延长细胞存活的细胞内蛋白，而Bax是Bcl-2同源基因，过度表达的Bax可促进细胞凋亡[13-15]。

图2 各组大鼠卵巢组织Bcl-2、Bax蛋白表达情况比较(免疫组化染色,×400)

卵巢颗粒细胞在卵泡生长中起到重要作用，相关激素均由卵巢颗粒细胞卵泡分泌，或在其上表达[16-18]。卵泡的生长主要是由FSH调节的，FSH由垂体分泌，负责卵巢卵泡的刺激和生长，而卵泡刺激激素受体(FSHR)主要在卵泡颗粒细胞上表达。E2由卵泡中的卵泡膜细胞和卵巢颗粒细胞产生，E2水平升高对下丘脑—垂体—卵巢轴FSH分泌呈负反馈调节。AMH可由原发性和继发性卵泡的颗粒细胞分泌，并抑制原始卵泡生长的发育，调控卵泡的发育速度。FSH和E2是主要的抗凋亡因子[19]。因此在VCD造模法诱导的DOR大鼠模型存在卵泡闭锁，AMH水平降低，FSH水平升高现象，干预后可改善DOR大鼠内分泌紊乱，改善卵巢状态，且补佳乐及杞月茶治疗效果相当。

Bcl-2家族已被证明在调节卵巢生殖细胞的命运中起着至关重要的作用。Bax是Bcl-2同源基因，二者互为拮抗作用，Bax蛋白表达水平上调，Bcl-2活性下降会促进细胞凋亡。Bax对原始生殖细胞、卵原细胞和卵母细胞凋亡有着重要作用[13]。Bax可从原始卵泡开始出现，而Bcl-2仅出现在原始卵泡向次级卵泡转化过程中，进而导致原始卵泡闭锁[19]。Bcl-2可通过抑制胚胎生殖细胞或生长卵泡的凋亡来增加原始卵泡数量，以潜在地延长卵巢功能和生育能力。其编码的蛋白主要存在于细胞质内，受到凋亡信号诱导后，其结构可发生改变，转移至线粒体膜上并形成通道，从而诱导细胞凋亡[20]。

多项研究中卵巢中Bax蛋白表达水平显著升高，Bcl-2蛋白表达水平降低，导致GC凋亡增加，导致大量闭锁卵泡[16]，与本结果部分相似。一项研究表明，细胞质Bcl-2阳性可阻止细胞凋亡，而细胞核Bcl-2阳性可抑制转录因子和核因子κB的活化，从而诱导细胞凋亡[21]。本结果中Bcl-2主要表达在细胞核中，其可能是导致细胞凋亡的另一因素。

综上，杞月茶及补佳乐可降低DOR大鼠血清中FSH水平、升高AMH水平，两者治疗效果与下调细胞凋亡因子Bax在卵巢组织中的表达有关。杞月茶与补佳乐治疗效果之间差别不大，但杞月茶代茶饮更为便捷，更适合大众保健的需求，可从中医治未病角度出发，防止DOR的进一步进展。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

肖慧:实施研究过程,数据收集、分析,论文撰写;刘宇:协助实验实施、数据收集;朱英英:协助数据分析;李军:提出研究思路和研究选题,设计研究方案、研究流程,设计论文框架,论文修订及审核