吸入高浓度氢气对大鼠肺缺血再灌注损伤的影响

李喆 吕建瑞 周华成

肺移植是治疗终末期肺部疾病的公认方法。在肺移植中，缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury , IRI)是限制肺移植成功的重要因素[1]，因此预防和治疗肺IRI在临床上都很重要。炎症反应和氧化应激是肺IRI的主要机制[2]。氢气具有抗炎症和抗氧化应激的作用，并且和氢气的浓度有关[3]。既往研究报道低浓度氢气的肺损伤保护作用[4]，但是高浓度氢气是否能更好的发挥肺损伤保护作用，尚未有研究。本研究将进一步探究高浓度氢气对大鼠肺IRI的影响及作用机制。

资料与方法

一、实验动物及分组

清洁级SD雄性大鼠，体重220～260 g，购自哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心。 SD大鼠随机分成3组(n=10)：假手术组(Sham 组)、缺血再灌注组(I/R 组)和氢气组(H2组)。

二、实验方案

大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠60mg/kg，气管切开后，连接小动物呼吸机(683型，Harvard公司，美国)行机械通气，潮气量10mL/kg，呼吸频率60次/分。左胸部去毛消毒，逐层分离暴露左侧肺门。尾静脉注射肝素钠200U/kg, 5 min后用血管钳于呼气末夹闭左侧肺门行左肺缺血30min，然后移除血管钳，行再灌注1h。Sham组只开胸，不建立缺血再灌注模型；I/R 组建立缺血再灌注模型，不吸入H2；H2组建立缺血再灌注模型，并且在再灌注期间吸入67%H2。使用Nano bubble 纯水氢气发生器(上海纳诺巴伯纳米科技有限公司)产生纯度为99%的氢气。将氢气和空气混合后通入密闭箱，在出气口用氢气检测仪(JK40-H2-P，深圳吉顺安科技有限公司)通过通气管路调定氢气的浓度。

再灌注1h后处死大鼠，取左肺下叶，按重量体积比1 ∶10加入生理盐水，在4℃进行组织匀浆，4℃ 12000g离心5min，取上清液作为待测样品。采用黄嘌呤氧化酶法测定上清液中SOD的活性(南京建成生物工程研究所，中国)，采用硫代巴比妥酸法测定上清液中MDA的浓度(南京建成生物工程研究所，中国)；采用ELISA法检测上清液中IL-6、TNF-α的水平(碧云天生物技术，中国)。提取组织蛋白，采用BCA测定组织蛋白浓度(碧云天生物技术，中国)，通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜，封闭。采用兔抗cleaved-caspase-3(1 ∶5000; Abcam)、兔抗cleaved-caspase-9(1 ∶5000; Abcam)和兔抗β-actin(1 ∶3000; Abcam)的一抗4℃孵育过夜，用TBST洗膜，孵育二抗，通过凝胶成像分析仪，将PVDF膜上的目的蛋白显像，拍照，通过Image J 软件计算其光密度值，并分析目的蛋白/β-actin的比值。

三、统计学方法

结 果

与Sham组比较，I/R 组和H2组上清液IL-6、TNF-α和MDA水平升高，SOD活性降低(P<0. 05); 与I/R 组比较，H2组上清液IL-6、TNF-α和MDA水平降低，SOD活性升高(P<0. 05)(见表1)。

表1 三组大鼠炎症指标和氧化指标的比较

与Sham组比较，I/R 组和H2组 cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9的蛋白表达明显升高(P<0. 05); 与I/R 组比较，H2组cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9的蛋白表达明显降低(P<0.05)(见图1～2)。

讨 论

肺脏IRI是限制肺移植成功的重要因素，肺脏缺血再灌注产生大量活性氧自由基，进而诱发急性炎症反应，以及局部浸润的炎症细胞释放大量TNF-α及IL-6等炎症因子，直接或间接造成肺组织炎症反应。活性氧自由基具有强烈的氧化作用，导致膜脂质过氧化增强，造成肺组织氧化应激反应[5]。同时，大量产生的活性氧自由基损伤线粒体内膜，细胞色素C被释放到细胞质中，激活下游的凋亡蛋白caspase-3和caspase-9，进而诱导细胞凋亡[6]。既往研究提示肺脏IRI主要与炎症反应，氧化应激及细胞凋亡有关[7-10]。本研究参照文献的方法制备肺缺血再灌注模型[11]。结果表明，I/R 组细胞凋亡明显升高，IL-6、TNF-α和MDA水平升高，SOD活性降低，进一步证实了肺脏IRI与炎症反应和氧化应激密切相关。因此，有效抑制肺脏缺血再灌注过程中的炎症反应和氧化应激是减轻肺脏IRI的重要途径。

图1 三组大鼠cleaved-caspase-3蛋白表达水平的比较

图2 三组大鼠cleaved-caspase-9蛋白表达水平的比较

既往研究发现H2在2%～4%浓度范围内是一种安全和有效的治疗气体，H2对肺损伤具有抗氧化、抗炎症等效应，但多局限于低浓度(<4%)-[12]。最近有研究发现吸入高浓度(67%)H2能够缓解哮喘小鼠气道的炎症反应和氧化应激损伤[13]，并且发现氢气的保护作用可能和浓度有关。本研究结果显示，高浓度氢气(67%)明显减少了IL-6、TNF-α和MDA的表达，增加了SOD的活性，明显减轻了肺脏IRI的细胞凋亡。提示高浓度氢气对肺脏IRI有保护作用，其机制与抑制炎症和氧化应激反应有关。

本研究有一定的局限性：(1)本次实验只检测了再灌注后1h的结果，时间比较局限，下一步将延长再灌注后的时间以及增加检测时间点；(2)本次实验氢气浓度范围比较局限，不同浓度的氢气效果对比需要进一步研究，以确定最适宜的氢气治疗浓度。

综上所述，高浓度氢气能够缓解大鼠肺缺血再灌注的炎症反应和氧化应激水平，进而减轻大鼠肺缺血再灌注损伤。