脑脊液中Dickkopf-1的表达与肺腺癌软脑膜转移发生发展及耐药性的相关性分析

俞婷婷 郑胜男 蒋澄 谢宇 尹震宇 郭爱斌 李会颖

软脑膜转移(leptomeningeal metastasis，LM)是肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)最严重的并发症之一[1]。目前临床上针对LM主要存在两个瓶颈，一是LM缺乏有效治疗手段；二是没有特异性标志物可用于LM早期诊断、疗效监测和预后评估。既往研究发现外周血中分泌型糖蛋白Dickkopf-1(DKK1)在肺癌早筛、诊断和预后等方面具有潜在应用价值[2-3]。对LM患者而言，脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)样本比血液样本更能准确地表征颅内肿瘤的真实状态[4-5]。目前还没有关于LUAD伴LM患者CSF中DKK1表达情况的研究报道。因此，本研究通过比较LUAD伴LM患者与非瘤对照者CSF中DKK1的表达差异，以及鞘内化疗期间DKK1动态变化情况，首次探讨分析了DKK1与LM的发病、耐药性、预后相关性，以期能为LM个体化治疗提供可靠指标，同时为难治型LM患者寻找更有针对性的靶点提供新思路和理论依据。

资料与方法

一、资料来源

本研究筛选了2019年12月至2021年05月期间就诊于南京鼓楼医院的经病理明确诊断的LUAD患者，经头颅(magnetic resonance imaging，MRI)或脑脊液细胞学明确诊断为LM，进行规律的培美曲塞鞘内化疗，最终入组20例患者。此外，纳入非瘤对照患者10例。所有入选患者均签署知情同意书，本院医学伦理委员会审批(2019-263-02)并同意开展本研究。

二、临床样本的收集

将研究对象分为对照组(Con组)和LM组，LM组依据RANO(Response Assessment in Neuro-Oncology)疗效评价标准具体分为：疾病稳定(stable disease，SD)，部分缓解(partial response，PR)，完全缓解(complete response，CR)和疾病进展(progressive disease，PD)。为便于后续的统计分析，本研究将疗效评价为PR、CR和SD的患者统一归入于疾病控制(disease control，DC)组。DC组的样本按照治疗周期的不同具体分为：DC-0C组(鞘内化疗前)，DC-2C组(两周期鞘内化疗后)，DC-4C组(四周期鞘内化疗后)。

主要的纳入标准：年龄18岁至75岁；初诊经病理诊断为肺腺癌，且经临床、病理、影像学评估确诊为肺癌软脑膜转移，至少有一个可评价病灶；美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)评分≤3分；无明显出血症状、出血性疾病及血栓性疾病；无明显心肝肾功能异常。主要的排除标准：对培美曲塞过敏或禁忌症患者；无法控制的癫痫；同时或既往有其它肿瘤病史；妊娠、哺乳期妇女。

入组患者经充分评估后行规律的培美曲塞鞘内化疗。详细收集患者相关的临床、病理、影像学资料。每2周期鞘内化疗后复查头颅+全脊柱磁共振、胸部CT、肿瘤标志物等，结合患者症状，参照RANO标准判断治疗疗效。收集LM患者治疗前后不同时间点的脑脊液标本6～10mL，对照组经腰椎穿刺留取脑脊液6～10mL。所有样本统一保存于-80℃冰箱中。

对所有入组患者进行随访，记录患者的无进展生存期(progression-free survival，PFS)。PFS为从鞘内化疗之日起至疾病发生进展或观察截止时间(2021年05月)为止，生存期以月表示。

三、检测方法

所用试剂与仪器：Human DKK1 Quantikine ELISA Kit 定量检测试剂盒为美国R&D Systems产品(DKK100B)，最低检测值：0.948pg/mL，检测范围：9.4～600.0pg/mL，酶标仪为Tecan公司产品。

使用前将ELISA试剂盒和CSF样品平衡至室温，按照试剂盒说明书具体操作如下：①每孔加入50μL样本稀释液；②每孔分别加入标准品、对照或CSF样本50μL，封板，室温温育120min；③自动洗板机洗板4次；④加入酶结合物200μL，室温温育120min后洗板4次；⑤每孔加入底物液200μL，室温避光显色30min；⑥加入终止液50μL，于30min内用酶标仪分别在450nm、540nm处测定各孔的吸光度值OD450、OD540值。仪器软件根据已知的标准品浓度和OD450、OD540值作出标准曲线，求出标准方程，通过样本OD450、OD540值计算浓度。

四、统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。DKK1浓度与PFS呈非正态分布，用M(Q1,Q3)表示，多组之间比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较用Mann-Whitney U检验；计数资料应用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。根据受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)及曲线下面积(the area under ROC curve，AUC)评估脑脊液中DKK1浓度诊断的敏感性和特异性。

结 果

一、基本情况

共纳入20例LUAD伴有LM的患者，年龄33～62岁，中位年龄48.4岁，男10例，女10例，男女比例1：1，共11 (55%)例，有吸烟史。基础突变中，共10 (50%)例，患者为EGFR L858R突变，4 (20%)例，为EGFR Del-19突变，另外6 (30%)例，为间变性淋巴瘤激酶 (anaplastic lymphoma kinase, ALK) 突变。从诊断为LUAD至发生LM，时间为8～63个月，中位时间25个月；诊断LM时患者的ECOG评分为1～3分。20例患者入组前评估肺部原发灶均稳定，6(30%)例合并脑实质转移 (brain metastasis, BM)，其中5例曾行全脑放疗 (whole brain radiation therapy, WBRT)。此外，大部分患者曾接受过培美曲塞联合铂类的双药化疗(17/20，85%)以及抗血管生成治疗(16/20，80%)。为加强颅外病灶的控制、发挥协同抗肿瘤的效果，鞘内化疗的同时患者均口服靶向药物，从而确保入组患者的最大生存获益，主要包括奥希替尼(Osimertinib)和劳拉替尼(Lorlatinib)。相关内容(见表1)。

表1 LUAD伴LM患者的基本情况[n(%)]

二、CSF中DKK1的表达

20例LUAD患者CSF中DKKl含量较10例非瘤对照升高，两组间差异有统计学差异(P<0.05)(图l，表2)。DC亚组及PD亚组较对照组DKK1表达均上调，但PD组升高更为显著(P<0.05)(图2，表2)。DKKl的表达与患者年龄、性别、吸烟史、ECOG评分、基础突变类型、发生脑膜转移的时间、是否合并脑实质转移、全脑放疗史、化疗史、抗血管生成治疗史、TKIs类型等均无统计学意义的相关性(P>0.05)。在DC组鞘内化疗的过程中，DKKl的表达水平整体呈现不断下降的趋势，其中DC-0C组与DC-4C组差异存在统计学差异(P<0.05)(图3，表3)。ROC分析表明诊断LUAD-LM的最佳CSF中DKK1临界浓度为139.36pg/mL，此时其敏感性为70%，特异性为80%，AUC为0.745(图4)。

图3 DC组患者不同治疗周期后的CSF中DKK1的表达

图4 LM组和对照组患者CSF中DKK1浓度ROC分析

表2 鞘内化疗前各组CSF中DKK1浓度对比

图1 LM组与对照组CSF中DKK1浓度对比

图2 鞘内化疗前各组CSF中DKK1的不同表达

表3 DC组患者不同治疗周期后CSF中DKK1浓度的动态变化

三、DKK1的表达与预后

DC组患者PFS为4.5～11个月，中位PFS为6个月，PD组PFS为1～6.5个月，中位PFS为2.25个月，两者之间存在明显差异(P<0.01)。以139.36pg/mL为截断点，DKK1高表达组(16/20)患者PFS为1～8.5个月，中位PFS为4.5个月；低表达组(4/20)患者PFS为4.5～11个月，中位PFS为7.25个月，两组的PFS比较差异具有显著性(P<0.05)。关联性分析显示，CSF中DKK1和PFS之间有显著相关性(Pearson相关系数为-0.528，P=0．017)。PFS与患者年龄、性别、吸烟状况、ECOG评分、基础突变、发生脑膜转移的时间、有无合并脑实质转移、既往治疗史、合并TKIs等均无统计学意义的相关性(P>0.05)。

讨 论

目前LUAD伴LM的治疗仍较为棘手，早期的诊断及精准的调整个体化的治疗方案对改善预后至关重要，但目前临床上仍缺乏灵敏诊断、动态疗效监测的有效方法。脑脊液细胞学是目前LM诊断的金标准，具有100%的特异性，但是由于技术水平、样本量有限等诸多原因，存在较多的假阴性，灵敏度仅75%，并且无法有效反应治疗过程中的疗效[6]。头颅及全脊柱MRI是另外一个重要的诊断手段，但是由于LM病灶可随着CSF循环弥散在整个中枢系统内，较少形成实性的肿瘤病灶，很多患者在疾病前期MRI无法显示，敏感性仅有70%，而且在治疗前后也无法对比病灶的大小评估疗效[7]。脑脊液的常规、生化检测及肿瘤标志物由于较低的敏感性和特异性，临床上仅作为辅助的诊断指标[8]。因此，临床上迫切需要一种更为可靠的特异性标志物。

Dickkopf(DKK)蛋白家族主要包括DKK1-4四种亚型，其中DKK1为一种分泌型糖蛋白可以抑制Wnt信号通路[9]。Wnt信号通路在生物进化过程中高度保守，可通过Wnt/β-catenin信号通路调控细胞的生长、发育和分化，已被证实与多种肿瘤的发生密切相关[9-11]。值得注意的是，DKK1在不同癌症中却发挥着截然不同的作用[9]。一些研究证实DKK1是一种抑癌基因，在乳腺癌、肠癌等肿瘤组织中低表达，可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制癌细胞增殖和转移[9]。与此相反，DKK1被发现可以促进肺癌的发生、发展，在肺癌患者的肺癌组织和血清中DKK1呈现高水平的表达[3]。但是目前尚无肺癌LM患者脑脊液中DKK1表达情况的相关研究。

BBB的存在使得颅内转移灶具有独特的局部微环境，因此相较于血液、胸水等，CSF是LM更为准确的液体活检样本[4-5]。我们首次对DKK1的表达情况及动态变化进行系统的检测，经各组的差异性分析有如下发现：(1)DKK1的表达水平在LM组和对照组CSF中存在显著差异，提示DKK1与LM的发生密切相关，并可作为LM诊断的潜在标志物，拥有较好的敏感性和特异性；(2)与DC组基线状态相比，两周期和四周期鞘内化疗后的LM患者CSF外泌体中DKK1的表达水平逐渐下降，说明DKK1与LM的鞘内治疗紧密相关，可能成为监测疗效的可靠指标；(3)相比于DC组，PD组中DKK1上调更为显著，DKK1高表达组PFS劣于低表达组，进一步说明DKK1与LM耐药性、不良预后相关。因此，上述研究结果均提示CSF中的DKK1对LUAD伴LM的发生和发展发挥了重要的作用。

既往有研究表明在非小细胞肺癌中，DKK1可抑制β-catenin的磷酸化，导致细胞质中游离的非磷酸化β-catenin增多、核定位增加，β-catenin进入细胞核中与T细胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴样增强因子(lymphoid enhancer factor，LEF)复合物相结合，激活下游靶基因，进而促进肺癌的发生、发展与转移[12]。例如，β-catenin核定位增加，可促进上皮间质转化(epithelia mesenchymal transition，EMT)的发生[12]，导致肺癌细胞的增殖、转移及耐药性，因此我们推测这可能与LM的发生及耐药相关，有待后续相关研究进一步证实。

综上所述，本研究通过检测分析LM患者CSF中DKK1的表达及动态变化，首次证实，其与LM的发生、发展及耐药密切相关，在指导用药、监测耐药、评估疗效及判断预后等方面具有广泛的应用前景。本研究样本量有限，后续将进一步扩大样本量验证相关结论，以期为LUAD伴LM寻找可靠的早期诊断、预后评估指标及新的防治策略，推进更为精准的个体化的肿瘤治疗。