猪脾转移因子提高Bartha-K61株伪狂犬病活疫苗免疫猪抗体水平的初探

陈上永

（寿宁县农业农村局，福建 宁德 355500）

转移因子（Transfer Factor,TF）是一种可转移致敏信息并具有特异和非特异性生物学活性的细胞因子，自从Lawrence等于1949年首次发现结核菌素阳性供体的活淋巴细胞（含有TF）可使皮试阴性受体转变为皮试阳性以来，TF成为了人类医学和动物医学研究的热点。Lawrence等随后5年的长期研究发现，从结核菌素阳性供体的白细胞中所获得的可透析物质（含有TF）同样可使皮试阴性受体转变为皮试阳性，同样具有活淋巴细胞的相同功能，即：活淋巴细胞及其可透析物质均具有转移迟发型变态反应的作用[1~3]。之后，在人类医学中TF被广泛用于各种感染性疾病、恶性肿瘤、免疫缺陷病的临床治疗，取得了较好的临床效果。1979年开始，TF被广泛应用于动物医学临床中，可提高动物免疫功能和疫苗免疫效果，具有广阔的兽医临床应用价值[4~9]。

在TF提高疫苗免疫效果的研究方面，本课题组利用传代细胞系建立了TF与狂犬病（Pseudorabies,PR）活疫苗联合免疫效果的体外评价方法[10]，但是缺少TF与PR活疫苗联合免疫的猪体内效力研究。基于此，本研究旨在明确TF提高伪狂犬病（Pseudorabies,PR）活疫苗（Bartha-K61株）免疫猪抗体水平的作用，按照本课题组具有自主知识产权的中国发明专利[11~14]，以猪脾脏为原料经匀浆、细胞破碎、灭活、微滤、超滤、除菌后制备3批猪脾TF， 通 过ELISA方 法 检 测PR活 疫 苗（Bartha-K61株）单独免疫、与TF联合免疫后猪PR病毒（PR Virus,PRV）免疫抗体的动态变化水平，以研究本发明专利所制备TF对PR活疫苗免疫效果的影响，为PR的预防控制和TF的临床应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

4~6周龄的PRV gB抗体阴性的健康杜长大仔猪，由福建某猪场提供。

1.2 TF制备

福建农业职业技术学院动物疫病研究室制备并提供3批猪脾TF，具体如下：按照本课题组具有自主知识产权的中国发明专利[11~14]，以健康猪脾脏为原料，经匀浆、细胞破碎、灭活、微滤、超滤、除菌后 配 制 而 成 ，3批 猪 脾TF分 别 为TF-1、TF-2、TF-3。经检验，所制备3批TF的脱E受体法效力分别为15.8%、16.1%和17.3%，核糖含量分别为62.2 μg/mL、59.5 μg/mL和58.8 μg/mL，多肽含量分别为2.85 mg/mL、2.78 mg/mL和2.98 mg/mL，pH值分别为6.91、6.95和6.94，细菌内毒素含量均不超过10 EU/mL，OD260nm/OD280nm的比值分别为2.21、2.29和2.31（均大于1.9），并且在253 nm处均有最大吸收峰，外源病毒检验、支原体检验、无菌检验、热原检查、蛋白质定性检验、过敏反应检查和安全检验均合格。

1.3 试剂

PRV gB抗体检测ELISA试剂盒，购自美国IDEXX公司；PR活疫苗（Bartha-K61株），购自国内某生物制品企业。

1.4 仪器

酶标仪为美国Thermo公司产品，型号为Multiskan MK3。

1.5 实验设计

选取PRV gB抗体阴性的健康杜长大仔猪50头，随机分为5组，每组均10头，分别为单独免疫组、联合免疫组1、联合免疫组2、联合免疫组3和空白组。其中，单独免疫组采用2 mL生理盐水稀释1头份PR活疫苗（Bartha-K61株），进行颈部肌肉注射单独免疫；联合免疫组1、联合免疫组2、联合免疫组3均分别采用TF-1（2 mL）、TF-2（2 mL）、TF-3（2 mL）稀释1头份PR活疫苗（Bartha-K61株），进行颈部肌肉注射联合免疫；空白组只注射2 mL生理盐水，见表1。各组猪均分别于免疫前3 d及免疫后第7 d、14 d、28 d、42 d和56 d经前腔静脉采血并分离血清，采用ELISA方法测定PRV免疫抗体的动态变化水平。

表1 试验组设计

1.6 PRV免疫抗体水平测定

按照PRV gB抗体检测ELISA试剂盒说明书进行检测，测定并且记录各组猪血清样品和ELISA试剂盒对照在650 nm处的吸光度值，通过计算每个样品与阴性对照吸光值的比率（S/N），判定样品PRV gB抗体水平：当S/N≤0.50，样品判定为PRV gB抗体阳性；当0.50＜S/N≤0.60，样品判定为PRV gB抗体可疑；当S/N＞0.60，样品判定为PRV gB抗体阴性。以PRV gB抗体表示PRV免疫抗体水平，计算PRV免疫抗体水平阳性率。

2 结果

结果显示（见表2），免疫后第7 d，单独免疫组的PRV免疫抗体阳性率为20%，而此时联合免疫组1、联合免疫组2和联合免疫组3的PRV免疫抗体阳性率分别为60%、60%和50%。免疫后第14 d，单独免疫组的PRV免疫抗体阳性率为60%，而此时联合免疫组1、联合免疫组2和联合免疫组3的PRV免疫抗体阳性率分别为80%、90%和100%。免疫后第28 d，单独免疫组、联合免疫组1、联合免疫组2和联合免疫组3的PRV免疫抗体阳性率均为100%。免疫后第42 d，单独免疫组的PRV免疫抗体为80%，而此时联合免疫组1、联合免疫组2和联合免疫组3的PRV免疫抗体阳性率均为100%。免疫后第56 d，单独免疫组的PRV免疫抗体阳性率为50%，而此时联合免疫组1、联合免疫组2和联合免疫组3的PRV免疫抗体阳性率分别为100%、90%和100%。本试验中空白组PRV免疫抗体阳性率始终为0%。结果表明，免疫后第7 d、14 d、28 d、42 d和56 d，联合免疫组的PRV免疫抗体阳性率分别比单独免疫组高30%~40%、20%~40%、0%、20%和40%~50%。

表2 PRV抗体阳性率检测结果 %

3 结论

PR是危害我国养猪业发展的主要疫病，PRV可侵害各种日龄阶段的猪，主要引起哺乳仔猪死亡，中大猪呼吸道病，母猪返情、屡配不孕、流产、木乃伊胎、死胎，以及公猪睾丸肿胀或萎缩、不育等[15]。疫苗免疫是PR防控的主要方法，目前PR基因缺失弱毒苗和PR灭活苗在兽医临床上被广泛应用。其中，PR活疫苗（Bartha-K61株）就是历史最悠久、应用最广泛的PR疫苗之一，被成功用于美国和欧盟的PR净化。但是，2011年以来我国多省市出现了以哺乳仔猪神经症状进而导致大量死亡、母猪死胎、流产为主要特征的PR暴发，许多免疫PR活疫苗（Bartha-K61株）的规模化猪场也时有发生，这些给我国PR防控提出了新的挑战[15~17]。TF是一种新型免疫增强剂，具有无抗原性、无毒、不引起过敏反应、安全等优点，已有研究显示，TF可增强机体免疫功能和疫苗免疫水平[18~26]。本研究结果显示，免疫后第7 d、14 d、28 d、42 d和56 d，TF可将PR活疫苗（Bartha-K61株）免疫猪的PRV免疫抗体阳性率分别提高30%~40%、20%~40%、0%、20%和40%~50%。结果表明，TF可以提高PR活疫苗（Bartha-K61株）的免疫抗体水平。

（感谢：福建农业职业技术学院和派生特（福州）生物科技有限公司共建福建省动物保健与食品安全应用技术协同创新中心的徐磊教授、刘毅发兽医师、钟云钦兽医师、蒋铃兽医师和谢杼倢兽医师对实验的指导和帮助!）