BRAF突变型黑色素瘤的耐药性机制及治疗最新研究进展

李细媛，朱智鑫，赵海龙△

黑色素瘤是一种源自皮肤、黏膜、葡萄膜和脑膜等部位黑色素细胞的恶性肿瘤，每年黑色素瘤患者病死率超过3.5%，转移性黑色素瘤患者的5年生存率仅为15%~20%［1］。黑色素瘤早期主要通过手术切除治疗，深度转移或已扩散至淋巴结者主要依赖免疫疗法、化疗和放疗等治疗手段［2］。在进展为黑色素瘤过程中，黑色素细胞常伴随丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路相关基因突变或蛋白过度激活，导致细胞增殖水平和侵袭能力过度增强［3］。约50%的黑色素瘤患者存在鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1（BRAF）突变，其中最常见的为BRAFV600E突变［4］。

目前临床上BRAF突变型黑色素瘤的靶向治疗药物以BRAF抑制剂和丝裂原活化的细胞外信号调节激酶（MEK）抑制剂组合为主，临床效果显著，患者肿瘤抑制率和总生存期均有明显改善［5］。然而，目前临床上已经出现大量对BRAF抑制剂或联合MEK抑制剂治疗黑色素瘤产生耐药性的病例，尤其在治疗后期出现了严重的药物相关不良反应并进一步发生肿瘤的恶性化转移［5］。本文重点讨论单药型BRAF抑制剂或联合MEK抑制剂治疗BRAF突变型黑色素瘤耐药性产生的机制，并归纳总结耐药后靶向治疗和免疫治疗的最新研究进展。

1 BRAF突变型黑色素瘤耐药性的发生机制

BRAF突变型黑色素瘤耐药性主要分为原发性耐药性、适应性耐药性和继发性耐药性，发生机制较为复杂，涉及肿瘤细胞内以及肿瘤微环境中基因、表观遗传和代谢等多方面变化［6］。

1.1 原发性耐药性 约20%接受BRAF抑制剂治疗的BRAFV600E突变型黑色素瘤患者在初次治疗期间即出现病情恶化且发生转移，说明部分黑色素瘤在发生发展初期就已经具有内在耐药性［7］。研究表明，在BRAFV600E突变的黑色素瘤细胞系和原位肿瘤中，内在基因突变和源自肿瘤细胞或基质的内源性分泌因子是诱发针对BRAF抑制剂原发耐药性的驱动因素之一［6］。

人第10号染色体缺失的磷酸酶-张力蛋白同源的基因（PTEN）是一种抑癌基因，也是磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信号通路的主要调节因子。BRAF突变型黑色素瘤中频发内源性PTEN突变和缺失［8］。He等［8］研究表明，PTEN缺失会激活BRAF突变型黑色素瘤中MAPK和PI3K-蛋白激酶B（AKT）信号通路，并通过抑制细胞凋亡蛋白Bcl-2相关性调节蛋白（BIM）介导的细胞凋亡进而诱发内在耐药性。Griewank等［9］发现，在BRAF突变型黑色素瘤中，视网膜母细胞瘤基因（RB）信号通路的失调驱动MAPK/PI3K信号通路的激活，进而引发细胞不受控制地增殖。此外，黑色素瘤细胞中RB信号通路中p16缺失的原因有细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子2A（CDKN2A）的缺失（50%～80%）、失活突变（16%）和表观遗传沉默（20%）［9］。Smalley等［10］发现在BRAFV600E突变型黑色素瘤中细胞周期蛋白D1（CCND1）存在过表达情况，与BRAF抑制剂耐药性的形成呈正相关。

大鼠肉瘤病毒癌基因同源（RAS）相关的C3肉毒素底物1（RAC1）作为Rho家族的小GTP结合蛋白，参与调节细胞增殖、细胞骨架重构和细胞迁移。其中RAC1P29S是黑色素瘤中继BRAFV600E（50%）和NRASQ61（20%）之后的第三大常见热点突变，占4%。RAC1P29S是一种激活性突变，促使RAC1发生磷酸化，导致细胞的增殖和迁移水平提高［11］。Uribe-Alvarez等［12］研究表明，BRAFV600E突变型黑色素瘤中内源性RAC1P29S与对BRAF抑制剂的早期耐药性有关，并且沉默RAC1P29S表达可以恢复细胞对BRAF抑制剂的敏感性。

神经纤维素-1（NF-1）是一种肿瘤抑制因子，可以通过抑制RAS表达来限制MAPK信号通路的激活。Tangella等［6］研究表明NF1的表达缺失与BARF抑制剂的耐药性呈正相关，尤其是在使用BRAF抑制剂维莫非尼（Vemurafenib）治疗黑色素瘤产生耐药性的患者中频发内源性NF-1基因突变。

MEK1/2蛋白是BRAF蛋白的下游分子，可促进细胞外调节蛋白激酶（ERK）磷酸化和MAPK信号传导［13］。Wagle等［14］研究发现，MEK1C121S的突变与细胞对BRAF和MEK抑制剂耐药性形成有关。同样，Carlino等［15］在使用BRAF抑制剂治疗BRAF突变型黑色素瘤时发现，内源性MEK1P124突变导致的耐药性是患者无进展生存期缩短的主要原因之一。

1.2 适应性耐药性 临床中应用BRAF抑制剂治疗后，黑色素瘤患者在治疗初期多数会出现肿瘤区域缩小，但黑色素瘤体不会完全消失［1］。目前普遍认为这是BRAF抑制剂诱导出现的补偿机制，可促使部分原始肿瘤细胞的存活能力增强，进而出现抑制剂治疗耐受情况，称为适应性耐药性。适应性耐药性的发生是可逆的，且不具有遗传性［6］。

小眼畸形相关转录因子（MITF）作为对黑色素细胞的早期生长和分化至关重要的主调控因子，参与黑色素瘤细胞侵袭、生存、细胞周期调节、自噬等诸多生物学过程［16］。在不同类型的黑色素瘤患者中MITF表达水平不一［17］。其中，MITF高表达患者出现原发黑色素瘤体积增大和增殖水平提高的现象，而MITF低表达患者则多出现侵袭性更高的转移性黑色素瘤［16］。Rathore等［18］发现耐药型黑色素瘤细胞系中MITF低表达，但侵袭性相关的核因子（NF）-κB信号通路和AXL的表达水平反而较高，说明MITF低表达与黑色素瘤耐药性表型的形成以及恶性程度增高存在密切关联。相反，Smith等［19］研究认为由配对盒基因（PAX3）介导的MITF高表达是黑色素瘤细胞早期非突变和可逆的药物耐受状态的驱动因素。如上所述，虽然黑色素瘤增殖和侵袭均参与黑色素瘤耐药性形成，但MITF呈现出截然相反的表达水平。此外，研究表明BRAF抑制剂治疗后黑色素瘤细胞在增殖和侵袭状态之间的表型转换，促使肿瘤细胞在早期治疗中快速适应和存活，导致耐药性出现［17］。但是，由于MITF参与的生物学过程十分复杂，其不同表达水平导致黑色素瘤进展方向不同的原因和机制尚不清楚，有待进一步研究。

1.3 继发性耐药性 继发性耐药性主要指最初有治疗效果并伴随肿瘤消退的患者在后续治疗过程中出现复发情况，是黑色素瘤患者最主要的耐药类型。继发性耐药性的产生主要与MAPK信号通路中基因突变情况有关，后者诱导MAPK信号通路过度激活或利用替代通路（如PI3K-AKT通路）绕过MAPK信号通路，进而导致肿瘤细胞过度增殖［20］。Johnson等［21］研究发现部分基因突变参与黑色素瘤继发性耐药性的产生，包括NRAS或KRAS突变、BRAF剪接变体、BRAFV600E/K扩增以及MEK1/2突变。

受体酪氨酸激酶（RTKs）是MAPK信号通路的上游蛋白。Sullivan等［22］已证明RTKs的上调可以通过激活RAS蛋白而直接激活MAPK信号通路。此外，胰岛素样生长因子1受体（IGFR1）、血小板衍生生长因子受体（PDGFR）β等均可上调RTKs表达，同时经非ERK依赖途径激活PI3K-AKT通路［22］。临床研究表明，BRAF抑制剂治疗可导致部分黑色素瘤细胞的RTKs表达水平上调，同时伴随MAPK信号通路或替代的PI3K-AKT信号通路激活，进而提高细胞增殖水平并形成耐药性［23］。

Yin等［24］研究发现在约28%的黑色素瘤中存在NRAS激活性突变，其中最常见的是NRASQ61R突变。NRAS突变体在被激活表达后通过诱导丝氨酸/苏氨酸激酶（RAF）的二聚化进而激活MAPK通路［24］。此外，在BRAFV600E突变型黑色素瘤中MEK1突变被证实与对BRAF抑制剂产生的继发性耐药性存在正相关［15］，同时，MEK1/2的组成性激活或药物结合位点的突变，还可以导致对MEK抑制剂耐药性的发生［25］。Little等［26］研究证实BRAFV600E突变扩增也是导致对MEK抑制剂产生耐药的主要因素，BRAFV600E扩增通过激活MEK，进而激活MAPK信号通路的下游组成蛋白来驱动细胞增殖，形成耐药性。

BRAFV600E剪接变体也可以产生对BRAF抑制剂的耐药性。Clark等［27］研究发现在耐药型BRAFV600E黑色素瘤细胞中存在异常剪接的BRAFV600E异构体，即p61BRAFV600E，该异构体缺乏包括RAS结合域（RBD）在内的外显子3-5，能够不依赖RAS途径进行二聚化，进而形成耐药性。Jiang等［28］研究发现PI3K与MAPK通路之间存在交叉传达，耐药型BRAF突变型黑色素瘤通过避开BRAF和MEK抑制剂靶向的蛋白位点，利用替代通路中AKT蛋白激活MAPK信号通路中的ERK以促进细胞生存。

总之，在单药型BRAF抑制剂和（或）MEK抑制剂联合治疗过程中是否产生继发性耐药性很大程度上取决于MAPK通路或替代通路的激活情况，而相关通路蛋白能够起到提示恶性程度的作用。此外，通过RTKs表达上调直接影响上述通路中部分基因表达水平也是耐药性产生的关键机制之一。然而，目前关于原发性耐药性和适应性耐药性发生机制之间的关联与区别仍不明确，还需进一步研究来阐明耐药性发生机制，以寻找新的治疗模式组合，以期同时预防2种耐药的发生。

2 耐药型BRAF突变型黑色素瘤治疗方案优化的现状及前景

如上所述，单药型BRAF抑制剂和（或）MEK抑制剂联合治疗BRAF突变型黑色素瘤均易产生耐药性，因此开发BRAF与MEK以外的其他靶点特异性药物或新的治疗方式已成为目前的研究热点。

2.1 ERK抑制剂 原发性和继发性耐药性主要涉及MAPK信号通路的重新激活，但通过抑制BRAF和MEK以阻碍MEK过度激活MAPK通路，仍然可能出现耐药性［6］。ERK在MAPK/ERK通路中发挥着独特的作用，可以使100多种不同的底物磷酸化，参与MAPK/ERK的激活或去激活反馈回路，而且只有1个MEK1/2的上游效应物。ERK的重新激活是大多数继发性耐药性机制的核心。因此，ERK抑制剂目前被认为是可以有效抑制MAPK通路并且减少耐药性产生的靶点［29］。

Germann等［30］发现Ulixertinib/BVD-523是一种新型的、可逆的、腺苷三磷酸（ATP）竞争性的ERK1/2抑制剂，具有高效能和ERK1/2选择性。在BRAFV600E突变型黑色素瘤细胞系异种移植模型中，Ulixertinib/BVD-523与BRAF抑制剂联合使用时产生了协同抗肿瘤增殖作用［30］。同样，在BRAF/MEK联合靶向治疗后产生继发性耐药的动物模型中，单药ERK抑制剂在体内外均有显著的抗肿瘤活性［31］。目前美国食品药物监督管理局（FDA）已将Ulixertinib/BVD-523列为治疗转移性BRAFV600E突变型黑色素瘤的快速通道药物之一［30］。

SCH772984是一种新型选择性的ERK1/2抑制剂，在BRAF、NRAS或KRAS突变的黑色素瘤细胞中具有纳摩尔效力，并能在可耐受的剂量下诱导异种移植动物模型肿瘤消退［32］。SCH772984还能有效地抑制对BRAF和MEK抑制剂联合靶向治疗耐药的黑色素瘤细胞中的MAPK信号传导和细胞增殖［32］。除此之外，还有较多处于临床试验阶段或临床试验完成但结果尚未公布的ERK抑制剂，如LY3214996［33］、GDC0994［34］等。ERK抑制剂已经是治疗BRAFV600E突变型黑色素瘤耐药性的研究热点之一。

2.2 AXL抑制剂 通过上述耐药性发生机制可见，RTKs是黑色素瘤适应性和继发性耐药性机制的重要组成成分。RTKs家族由Tyro-3、AXL和Mer组成，尤其是AXL异常表达与癌症的发展、耐药性有关，并参与包括黑色素瘤在内的多种肿瘤免疫逃逸；而在BRAF突变型黑色素瘤细胞系中也频发AXL高表达、MITF低表达的耐药表型［18］。已有研究探讨AXL抑制剂治疗耐药型BRAF突变型黑色素瘤的效果，如尚在临床试验阶段的BGB-324/Bemcentinib（Ⅰ型）［35］、LDC1267（Ⅱ型）［36］等。

AXL-1047-MMAE是一种抗体偶联药物（ADC），可以在黑色素瘤动物模型体内外诱发细胞毒性。以AXL抑制剂为基础的ADC治疗不仅可以防止BRAF抑制剂耐药性产生，而且能增强BRAF和MEK抑制剂联合使用的疗效，共同抑制耐药细胞生长，并且对MAPK通路抑制剂有抗性的黑色素瘤具有显著疗效［37］。

2.3 抗程序性死亡受体/配体-1（PD-1/PD-L1）抗体 针对黑色素瘤的免疫原性，以PD-1及其配体PD-L1为靶点的免疫治疗是目前临床研究热点之一。PD-1是一种重要的免疫抑制分子，通过抑制T细胞活性来抑制免疫系统，而抗PD-1单克隆抗体能够阻断PD-1受体，维持T细胞激活状态以抑制肿瘤生长［38］。因此靶向PD-1的抗体，无论是单一疗法还是与抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）药物联合治疗在临床上已经显示出治疗转移性黑色素瘤的前景［39］。

尼伏单抗（Nivolumab）是一种人IgG4抗PD-1单克隆抗体，可以特异性附着于T细胞的PD-1受体上，防止T细胞的失活。其与另一种针对淋巴细胞中PD1受体的人源化单克隆抗体潘利珠单抗（Pembrolizumab）于2014年被FDA批准用于黑色素瘤的治疗［40］。针对PD-L1的IgG1同种型的全人源化单克隆抗体阿替珠单抗（Atezolizumab），以及另一种可同时阻断PD-L1与PD-1和CD80分子相互作用的单克隆抗体度伐单抗（Durvalumab），尚处于验证BRAF突变型黑色素瘤患者治疗效果的临床试验阶段［1］。

最新研究表明，靶向治疗与免疫治疗的联合使用可以加强对肿瘤生长的控制，但伴有明显的不良反应，比如肝功能不全、热射病等［41］。同时，靶向治疗和免疫治疗的给药先后顺序也有局限性，如MAPK靶向治疗可能诱导肿瘤出现抗PD-1的转录特征，从而形成针对免疫治疗的耐药性［42］。

2.4 抗CTLA-4抗体 除PD-1外，CTLA-4也是黑色素瘤治疗过程中的重要靶点之一［39］。CTLA-4在调节性T细胞和衰竭的活化T细胞上表达，与T细胞表面受体CD28共享B7配体（CD80和CD86）。当CTLA-4与抗原提呈细胞的B7配体（CD80和CD86）结合后，通过内吞转运作用抑制T细胞激活，产生免疫抑制反应。因此，肿瘤细胞可通过表达CTLA-4及相关受体蛋白，发挥后者的免疫抑制特性，进而能够逃避T细胞及相关免疫反应的攻击，完成免疫逃逸［43］。

伊匹单抗（Ipilimumab）于2011年被FDA批准作为抗CTLA-4单克隆抗体药物，用于治疗不可切除或转移性的黑色素瘤［40］。2015年FDA批准Ipilimumab联合Nivolumab治疗黑色素瘤，但该组合容易出现药物毒性反应，目前，在保持原有疗效的情况下，通过改变药物剂量或调整给药顺序以减少该药物毒性反应的研究尚处于临床试验阶段［40］。其他抗CTLA-4抗体药物如替西木单抗（Tremelimumab）、BCD-145治疗黑色素瘤的研究仍在临床试验阶段［1］。

2.5 表观遗传疗法 近年来表观遗传学是基因表达调控研究的热点之一，异常的表观遗传修饰能够通过诱导肿瘤细胞产生耐药性，从而降低化疗药物的效果［44］。因此，逆转或修复异常表观遗传修饰可以为治疗耐药型BRAF突变型黑色素瘤提供新的治疗思路［45］。DNA甲基化是最早被发现、研究最深入的表观遗传调控机制之一，然而在黑色素瘤治疗过程中DNA甲基化状态异常与耐药性形成机制的关系暂不明确，同时相关DNA甲基化转移酶（DNMT）抑制剂临床研究不够深入，DNMT抑制剂能否有效降低BRAF突变型黑色素瘤耐药性并改善治疗效果还需进一步研究与探讨。

3 总结与展望

综上，随着耐药性机制研究的逐步细化和深入，靶向治疗药物的选择范围也在逐渐扩大，包括新的BRAF和MEK抑制剂，以及其他靶点抑制剂的单药使用或联合使用。此外，免疫治疗也是一个新的关注领域，多种相关药物正处于研究或临床试验阶段，就目前试验效果来看，有可能实现对BRAF突变型黑色素瘤的长效控制。针对耐药型BRAF突变型黑色素瘤迫切需要进一步的基础和临床研究，开发临床应用范围更广的靶向药物以及改善免疫微环境的个性化免疫治疗方案，提供更多的研究数据以便制定联合用药的最优疗程与组合方式。