PCDH9影响过敏性鼻炎鼻黏膜上皮屏障功能的体外研究

王麒淇 蓝 凤 王 晶 郝柳思琪,2 李 艳 张 罗,2,3,4*

(1.北京市耳鼻咽喉科研究所，鼻病研究北京市重点实验室，北京100005；2.首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科，北京100730；3.首都医科大学附属北京同仁医院过敏科，北京100730；4.中国医学科学院慢性鼻病诊疗策略研究创新单元，北京100730)

过敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)，又称变应性鼻炎，是指鼻腔黏膜接触过敏原后，引起免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)介导的炎症反应，临床上主要表现为鼻痒、流清涕、阵发性喷嚏及鼻塞[1-2]。近年来AR患病率逐渐升高[3-4]，中国大中城市AR的自报患病率从2005年的11.1%上升到2011年的17.6%，并且15%～38%的AR患者伴发哮喘[5]，已经成为严重影响全社会人群健康和生活质量的公共健康问题。

鼻腔黏膜上皮屏障损伤导致过敏原渗透增加、分泌炎症因子共同导致过敏反应，是AR的主要病理特征，与紧密连接、黏附连接等多种细胞连接蛋白表达改变密切相关[6]。多个研究小组[7-9]发现闭锁连接蛋白1(zonula occludens protein 1，ZO-1)表达水平降低与AR鼻黏膜上皮屏障功能损伤有关[7]，屋尘螨抗原Derp1[8]、颗粒物[9]等可以使AR患者鼻上皮细胞ZO-1膜定位减少，上皮屏障通透性增加。研究[10-11]显示，激活Wnt/β-catenin通路能够抑制ZO-1表达，在卵清蛋白(ovalbumin, OVA)诱导的小鼠AR模型中，抑制Wnt/β-catenin激活可以显著抑制鼻黏膜炎症水平[12]，但Wnt/β-catenin通路激活水平对AR鼻黏膜上皮细胞ZO-1表达的影响和作用机制尚不明确。

原钙黏蛋白9(protocadherin 9, PCDH9)是原钙黏蛋白家族的一员[13]，研究[14-16]显示，PCDH9基因多态性与慢性阻塞性肺疾病[14]、哮喘[15]相关，能够参与Wnt通路调控[16]，目前尚缺乏PCDH9在AR鼻黏膜上皮中的相关研究。本研究拟探讨PCDH9是否通过调控Wnt通路激活水平影响AR鼻黏膜上皮屏障功能，为进一步理解AR患者上皮屏障损伤的发生机制，寻找新的药物研发靶点提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

以2019至2021年在首都医科大学附属北京同仁医院鼻过敏科的8例AR患者为病例组，8例非AR健康人为对照组，收集鼻黏膜鼻刷上皮细胞。AR患者入组标准：①AR诊断标准参照2015年《变应性鼻炎诊断和治疗指南》[17]标准和过敏原检测结果；②血清过敏原IgE检测阳性；③鼻塞、清水样涕、鼻痒和喷嚏等症状2项或2项以上；④查体可见鼻黏膜苍白水肿、清水样分泌物。排除标准：①真菌性鼻窦炎，鼻息肉，囊性纤维化，黏液囊肿，鼻腔鼻窦良、恶性肿瘤等其他鼻部疾病；②一般禁忌证，如自身免疫等疾病患者；③使用口服或鼻喷糖皮质激素4周或抗生素2周[18]。对照组为年龄18～60岁的健康人。本研究通过首都医科大学附属北京同仁医院伦理委员会批准(批号：TRECKY2019-026)，所有患者均签署知情同意书。

1.2 生物信息学分析

从可公开获得的GEO(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)数据库中下载包括对照组、AR鼻黏膜上皮细胞转录组数据(GSE118243)，并应用GEO2R在线工具分析AR和正常对照组鼻黏膜的差异基因，选取P<0.05的差异基因。应用DAVID Bioinformatics Resources 2021对差异基因功能进行基因本体(gene ontology, GO)功能富集在线分析(FDR<0.25)。STRING 11.5进行蛋白相互作用网络分析，并用Cytoscape 3.7.2绘制蛋白相互作用网络图。Panther进行基因功能富集通路分析(http：//pantherdb.org)。

1.3 细胞培养和转染

人鼻黏膜上皮细胞系(human nasal epithelial cells，HNEPC)(广州吉妮欧生物科技有限公司)和人正常支气管上皮细胞(bronchial epithelial cells， BEAS-2B) [艾凡(上海)生物科技有限公司]，DMEM完全培养基于37 ℃，5%(体积分数)的CO2培养箱中培养。将细胞接种于6孔板中，每孔3×105个细胞，培养24 h后，按Lipofectamin 3000说明书对细胞转染，对PCDH9进行过表达或敲除，PCDH9-siRNA和对照siRNA (每孔10 μmol/L，圣克鲁斯生物技术，sc-76086，sc-37007)，GV141-3Flag-PCDH9和GV141载体对照(1μg/孔)购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。细胞过表达或敲除PCDH9后继续培养48 h，进行实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction, Q-PCR)或Western blotting实验。

1.4 Q-PCR

提取细胞总RNA，反转录为cDNA，Q-PCR检测PCDH9：上游引物3′-ATGGCAACTCTGATCCCAAC-5′，下游引物3′-CGGTCATTGAACTGGTTCCT-5′;ZO-1：上游引物3′-AGGAGGTAGAACGAGGCATCATCC-5′，下游引物3′-TCTCCAGAAGTCAGCACGGTCTC-5′;CTNNB1：上游引物3′-TGGATTGATTCGAAATCTTGCC-5′，下游引物3′-GAACAAGCAACTGAACTAGTCG-5′;GAPDH：上游引物3′-GATTCCACCCATGGCAAATTC-5′，下游引物3′-CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-5′。

1.5 Western blotting

提取细胞总蛋白，Western blotting检测ZO-1(#13663, CST公司，美国)，β-catenin(#8480, CST公司，美国)，PCDH9(Proteintech，25090-1-AP)表达水平，β-actin(#4970, CST公司，美国)作为内参蛋白，Image J软件分析条带灰度进行半定量统计。

1.6 统计学方法

使用GraphPad prism 9软件绘图，SPSS 26.0统计分析，根据两组数据正态性检验结果，分别采用t检验或Mann-Whitney秩和检验进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCDH9基因在AR患者鼻黏膜上皮细胞中的表达水平

与正常组相比，AR患者鼻腔黏膜上皮细胞中有4 287个基因表达上调，119个基因表达下调，对差异表达基因进行GO功能富集分析，发现生物学过程(biological process, BP)主要与G蛋白偶联受体信号通路、检测与嗅觉感知有关的化学刺激、细胞黏附有关；细胞组成(cellular component, CC)也主要集中在膜的组成部分、质膜以及胞外区上；分子功能(molecular function, MF)主要与G蛋白偶联受体活性、RNA聚合酶Ⅱ相关功能以及嗅觉受体活性相关(图1A)。其中黏附连接的改变与AR患者鼻黏膜上皮屏障损伤显著相关，采用STRING分析参与调控黏附连接的39个差异基因的蛋白相互作用网络(protein-protein interaction，PPI)，发现CDH4、NLGN1、TNFAIP6、PCDH9、PRPH2、CDH11、PCDHA9、RS1、RNASE10、PCDHA4、CXCL12和PCDHA12表达水平上调，CX3CR1、SELP表达水平下调(图1B)。并且参与调控黏附连接的39个基因中有6个基因(PCDH9、PCDHA4、CDH11、PCDHA9、PCDHA12、CDH4)与Panther中Wnt通路调控有关(图1C)。进一步Q-PCR检测发现，AR组患者鼻黏膜上皮细胞中PCDH9表达(中位数11.16)明显高于正常对照组(中位数0.053)，差异有统计学意义(P<0.01)，表明AR组患者鼻黏膜上皮中PCDH9表达显著上调(图1D)。

图1 AR患者鼻腔黏膜上皮细胞中PCDH9基因表达水平显著增高Fig.1 PCDH9 is significantly upregulated in nasal epithelial cells of AR patients

2.2 PCDH9促进鼻黏膜上皮细胞ZO-1基因表达

在HNEPC细胞中分别过表达或敲除PCDH9，Q-PCR检测参与鼻黏膜上皮细胞紧密连接的关键基因ZO-1的表达水平，结果显示：干扰HNEPC细胞中的PCDH9(0.5±0.12vs1.05±0.06，t= 7.25，P=0.002，图2A)表达能显著抑制ZO-1(0.76±0.12vs1.05±0.06，t= 3.68，P=0.02，图2B)基因的表达，过表达PCDH9(32.3±16.97vs1.04±0.03，t= -3.19，P=0.03，图2D)可以促进ZO-1(1.42±0.19vs1.01±0.01，t= -3.68，P=0.02，图2E)基因表达。

2.3 PCDH9抑制β-catenin蛋白表达，促进鼻黏膜上皮细胞紧密连接ZO-1表达

在BEAS-2B细胞和HNEPC细胞中分别过表达或敲除PCDH9，Western blotting检测ZO-1、β-catenin的蛋白表达水平，结果显示：BEAS-2B或HNEPC细胞过表达PCDH9(BEAS-2B：1.25±0.38vs0.52±0.15，t=-5.44，P=0.03; HNEPC： 1.97±0.67vs1.10±0.44，t=-4.66,P=0.04)可以抑制Wnt信号通路关键蛋白β-catenin表达(BEAS-2B：0.65±0.40vs1.00±0.34，t=7.59，P=0.02; HNEPC： 1.09±0.51vs1.63±0.72，t=4.35,P=0.049)，促进ZO-1表达(BEAS-2B： 1.22±0.29vs0.82±0.17，t=-5.95，P=0.03; HNEPC：1.61±0.25vs0.75±0.26，t=-4.72,P=0.04)(图3A、B)。

进一步的研究显示，敲除PCDH9(BEAS-2B：1.01±0.48vs1.34±0.60，t=4.51，P=0.046; HNEPC：0.93±0.21vs1.32±0.30，t=7.32,P=0.02)可以促进β-catenin(BEAS-2B： 1.48±0.42vs1.01±0.27，t=-4.78，P=0.04; HNEPC：1.11±0.12vs0.93±0.05，t=-4.36,P=0.049)的蛋白表达，同时ZO-1(BEAS-2B： 0.39±0.50vs0.94±0.63，t=6.35，P=0.02; HNEPC：0.32±0.51vs1.21±0.37，t=9.30,P=0.01)表达水平降低(图3C、D)。

图2 PCDH9促进鼻黏膜上皮细胞ZO-1基因表达Fig.2 PCDH9 increases ZO-1 mRNA expression in human nasal epithelial cells(HNEPC)

图3 PCDH9降低鼻黏膜上皮细胞β-catenin表达，增强ZO-1表达Fig.3 PCDH9 decreases β-catenin expression and enhances ZO-1 expression in nasal epithelium cells

3 讨论

鼻腔黏膜上皮屏障损伤是AR疾病的主要特征和致病原因，鼻黏膜上皮细胞紧密连接和黏附连接的破坏使过敏原渗透增加，激活Th2型炎症反应，导致过敏反应[19]。

本研究首先通过对GEO数据库中GSE118243基因芯片数据进行分析。AR和正常鼻黏膜上皮细胞的差异基因参与的生物学过程和功能主要与细胞黏附、细胞膜的组成部分、质膜以及胞外区相关，这些通路功能的改变都和鼻黏膜上皮屏障功能相关。鼻腔黏膜上皮屏障功能主要受上皮细胞-细胞连接的调节，包括顶端紧密连接(tight junctions，TJs)和细胞间的黏附连接[20]，多项研究[9,21]显示，AR患者鼻黏膜上皮细胞ZO-1、E-cadherin、Occludin表达水平降低。对参与细胞黏附的差异基因进一步进行蛋白相互作用网络分析和Panther通路分析，发现PCDH9、PCDHA4、PCDHA9、PCDHA12、CDH11、CDH4同时与Wnt通路调控有关。CDH11和CDH4属于钙黏素家族；PCDH9属于原钙黏蛋白家族δ亚组，PCDHA4、PCDHA9和PCDHA12属于α组[22]。研究[23]显示，原钙黏蛋白家族在中枢神经系统发育中扮演重要角色，在过敏性鼻炎中的作用还鲜有报道。近年来研究[24]显示，多种δ组PCDHs蛋白参与Wnt通路调控，PCDH8可以直接与Frizzled结合激活Wnt通路，PCDH11Y可以促进β-catenin入核。Wnt通路广泛参与调控上皮组织的结构和功能，脂多糖激活Wnt/β-catenin通路使肺泡上皮细胞ZO-1表达降低，导致肺纤维化[10]；脑再灌注损伤促进β-catenin表达，抑制ZO-1、Occludin及Claudin-1表达，导致血-脑脊液屏障损伤[11]。在OVA诱导的小鼠AR模型中，抑制Wnt/β-catenin激活可以显著抑制鼻黏膜炎症水平[12]，因此Wnt通路可能参与AR鼻黏膜屏障损伤调控，本研究对可能发挥直接调控Wnt-β-catenin通路作用的δ组原钙黏蛋白PCDH9在AR和正常鼻黏膜上皮细胞进行进一步验证，发现PCDH9表达水平在AR鼻黏膜上皮细胞显著升高。

进一步研究PCDH9对鼻黏膜上皮屏障的影响，发现在BEAS-2B或HNEPC体外培养模型中，PCDH9能够促进ZO-1表达，同时抑制β-catenin表达，说明PCDH9可能通过抑制Wnt通路激活水平，促进鼻黏膜上皮细胞紧密连接蛋白表达。研究[16,25-27]显示，PCDH9在肝癌[16]、胃癌[25-26]、胶质瘤[27]等肿瘤中表达水平显著下调，能够抑制肿瘤细胞的增殖和转移。miR-155-5p能够促进PCDH9表达，高表达的PCDH9能促进β-catenin降解复合体GSK-3β的活性[16]，进而促进β-catenin磷酸化降解[28]。PCDH9本身作为原钙黏蛋白家族的一员，发挥构成细胞连接的生理功能。在本研究体外培养模型中，PCDH9表达能够促进ZO-1表达，但在体内，一项特应性皮炎研究[29]显示，13q21.31区域的单核苷酸多态性与疾病密切相关，13q21.31区域是IgE的主要基因座，PCDH9是距离该区域最近的基因，因此笔者推测PCDH9在AR中显著升高可能与鼻黏膜屏障损伤炎症的负反馈调节以及基因组水平调控相关，此现象的具体机制仍需要在小鼠等在体模型中进一步研究。

本研究显示PCDH9在AR患者鼻黏膜上皮中表达水平增加，在体外能够促进鼻黏膜上皮细胞紧密连接蛋白的表达，抑制Wnt通路激活水平，研究有助于认识PCDH9在AR及鼻腔上皮屏障中发挥的作用和机制，提高对上呼吸道变态反应相关疾病发病机制的科学认识水平，为未来针对AR上皮屏障的治疗提供理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明王麒淇：研究设计，论文撰写；蓝凤、李艳：数据分析；郝柳思琪、王晶：细胞实验等；张罗：研究设计，论文审定。