聚偏氟乙烯（PVDF）膜的漆酶固定化及其应用研究进展

周东锐，张献坤，张佳琦

（沈阳建筑大学，辽宁 沈阳 110168）

漆酶作为一种常见的氧化还原酶，由于其易获取、催化效率高等特点被广泛应用于污水处理中，目前国内漆酶的应用主要集中在含酚废水处理、染料废水脱色、降解有毒物质等方面。特别是其反应产物是水，不产生二次污染，因此其本质上是一种环保型酵素。

1 漆酶简介

漆酶，又称对苯二酚氧化酶，属于多铜氧化酶类，具有高效的氧化性和稳定性。漆酶来源广泛，主要分布于动物、植物、微生物中，大致分为漆树漆酶和真菌漆酶两类。真菌漆酶属于胞外蛋白，可以通过生物工程、微生物培养等方式大量获取，因此成为众多学者的研究对象。漆树漆酶又称为生漆，主要从漆树上获取，虽然我国生漆资源丰富，但目前对于漆树漆酶仍缺乏深入的研究[1-2]。

漆酶氧化还原电位各不相同，可以氧化多种化合物，甚至包括二价锰以及多种脂在内[3-4]。漆酶氧化还原电位主要受相对分子质量和铜离子周围氨基酸的空间位阻的影响，相对分子质量或铜离子周围氨基酸的空间位阻越大，漆酶的氧化还原电位越高。漆酶对底物的氧化机制大致可分为3种：漆酶将底物直接氧化成激发态分子；漆酶利用介导介质的激发态氧化氧化还原电位较高的底物；漆酶通过加入黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅酶促进催化底物。虽然漆酶的氧化范围广，但游离态漆酶的热和酸碱稳定性较差，且难以重复使用，因此，它的应用价值有限。将漆酶固定化不仅可以有效地解决这些问题，还可以解决游离态漆酶漏失的问题，减少外部环境对漆酶的影响，扩大其应用前景。

2 漆酶固定化技术

对几种固定化方法的特点及常用载体进行对比，结果如表1所示。

表1 固定化技术常用方法

目前漆酶的固定化技术有共价结合法、吸附法、交联法、包埋法等[5-8]，每种技术都离不开载体，因此，载体的选择显得尤为重要，直接影响了漆酶的固定化效果和利用率[9-12]。研究者们通过对比不同的载体材料进行固定化研究，对酶固定化技术不断创新。

3 PVDF膜表面的漆酶固定化方法研究

高分子膜材料是材料领域的后起之秀，具有选择透过性和结构伸缩性，在催化过程中实现物质分离[13]。PVDF膜更是由于其较高的机械强度和热稳定性成为理想的固定化载体材料。但是目前在漆酶的膜固定化方面仍缺少详尽的介绍。按漆酶的加入时间可分为成膜前固定和成膜后固定两种，但是大部分方法都需要对膜载体进行改性处理，通过物理、化学等手段引入大量易于漆酶结合的官能团，提高漆酶的固定化效果[14-15]。

3.1 成膜前漆酶固定化方法

成膜前固定漆酶就是将漆酶与铸膜液混合均匀，然后利用相转化法制备多孔膜，从而将漆酶包埋于聚合物基质中形成纳米颗粒，这是唯一一种不需要对膜表面进行修饰的方法，而且固定化后的漆酶不易脱落，因此，可大大减少成本。刘瑞红[16]等采用静电纺丝技术，根据自制的装置在生成 PVDF中空纤维膜的同时原位固定漆酶。经检测发现高达81.3%的漆酶成功固定在膜片表面，且固定化漆酶可保持游离态漆酶80%的活性，在经过7天储存后，其相对活性仅降低了18%。这有力地说明膜前固定在平衡酶活性和固定效率两方面具有较大的优势。

但目前膜前固定存在两大难点：第一，由于漆酶存活的最适温度为 25～40 ℃，而制膜时铸膜液温度较高，通常高于漆酶最适合存活温度，因此成膜前固定化漆酶，首先要解决漆酶在高温下的存活和热稳定性问题；第二，漆酶溶液中存在水分，在与铸膜液混合时易团聚成团，无法成膜。

现有的提高漆酶热稳定性的方法有蛋白质工程、固定化、化学修饰、非共价修饰等。蛋白质工程最常见的是基因诱变，但由于该技术相对复杂，目前对这方面的研究相对较少，鉴于国内目前已掌握了超过300个蛋白质三维结构及其规律性认识，蛋白质工程因其可以定向地赋予酶蛋白学者们想要的功能，必将成为未来新的研究方向。由于其化学修饰是通过“切割”或“剪接”主链和“化学修饰”侧链来改造蛋白质分子，这种方法使酶结构破坏严重，极大程度地改变了酶的性能。非共价修饰可有效地保护酶的天然构象，使酶形成更准确的催化部位，使其更易与底物相结合。张全升[17]等用二氧化硫脲和 L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐对漆酶进行改性处理，并在 72 ℃高温下考察改性后的漆酶活力，结果发现改性漆酶活性分别提高1.3%和56.9%。这种方法操作简单、反应时间短，是所有改性方法中最温和的一种，在酶改性领域应用广泛。花秀夫[18]等在二甲基亚砜和邻苯二甲酸酐溶液中对漆酶进行修饰，结果发现修饰漆酶与天然漆酶光学特性相似，在 55 ℃时修饰漆酶的半衰期较天然漆酶长，适宜的pH范围从5.9～7.8变为4.5～8.4。这表明该种方法有效地提高了漆酶的热稳定性和酸碱稳定性。何小勇[19-20]等采用添加多羟基化合物的方法提高漆酶热稳定性，分别考察肌醇、葡萄糖、甘露醇、甘油、山梨醇等 5种物质在 20、30、40、50、60、70 ℃下漆酶的活力。通过对比发现在 20～60 ℃范围内漆酶活力均呈现先增大后减小的趋势，但酶活均高于天然漆酶，且在 70 ℃高温下改性漆酶的半衰期远远高于天然漆酶。这表明多羟基化合物的加入可有效提高漆酶热稳定性，且对改性剂添加量的不断优化可进一步加强漆酶活力。

综上，提高漆酶的存活温度和热稳定性是可行的，但目前尚没有将其应用到漆酶的膜固定化中，未来可通过以上几种方法对漆酶进行改性处理，或者可以将在高温下存活下的漆酶进行富集培养，提高漆酶在高温下的存活率，然后将改性后的漆酶加入到N,N-二甲基酰胺（DMF）溶液中，搅拌均匀后混入铸膜液中，调整温度后进行刮膜处理，从而实现在成膜前固定漆酶。

3.2 成膜后漆酶固定化方法

成膜后固定漆酶就基于酶固定化的几种方法（吸附法、共价结合法、交联法、包埋法）将漆酶固定在载体表面。相比于成膜前固定的方法，在成膜后对漆酶进行固定是目前的研究重点。

吸附法可以将制备好的PVDF膜浸泡在以一定比例配置的漆酶溶液中，利用漆酶与膜载体间的氢键、疏水键、离子键合力、静电作用将漆酶固定在膜上。但这种作用力通常较小，因此需要引入不同的添加剂对膜片进行改性处理。通过对各种实验参数的调整亦可将固定效果达到最佳。FAN[21]等采用聚多巴胺（PDA）涂覆PVDF膜片，然后在PDA涂层表面接枝聚乙烯亚胺（PEI），使其表面带正电。采用正向过滤的方式利用静电作用吸附漆酶。测试发现漆酶固定化纯度高达 92.2%，漆酶表达活性仅为 19.6%左右，这表明漆酶固定效率更高，但同时使酶结构的灵活性受限，因此酶表现活力较低。在4 ℃、pH为4.5的条件下，经储存45天后漆酶活性仅损失了13%，而游离态漆酶则几乎完全丧失活性。这表明固定化使漆酶的稳定性得到了较大提高。

利用交联法将漆酶固定在膜上，通常需要添加带有双官能团或多官能团的交联剂（例如戊二醛、二羧酸），但是这种方法获得的交联结构机械性能差，因此常常与其他固定方法联合使用。何洋[22]等采用原子转移自由基聚合（ATRP）法制备聚乙二醇甲基丙烯酸酯（PVDF-g-PGMA）共聚物，使膜表面引入可固定漆酶的官能团，利用共价结合的方法固定漆酶，最后利用聚醚酰亚胺（PEI）交联漆酶固定化 PVDF-g-PGMA膜。经测试发现未经交联的漆酶固定化膜在8 h的降解效率为71.3%，而交联后的漆酶表现出更佳的降解效率，在8 h的降解效率可高达93.5%。在经过4次循环使用后未经交联与交联后的漆酶均能保持高于90%的活性，但当重复使用10次时，交联后的漆酶可保留高于80%的活性，而未经交联的漆酶仅剩65%的活性。

包埋法就是将配好的漆酶溶液滤过聚合物膜，在过滤过程中实现漆酶的固定。这种方法通常不需要添加交联剂，对酶结构影响最小，但较少应用于PVDF膜上。近五年来尚未有基于PVDF膜的包埋法固定漆酶的论述。罗建泉[23]等基于“膜污染思维”采用逆向过滤的方式将漆酶包埋固定，该固定化方法较为完善，膜载体的选择主要集中在纤维素超滤膜和聚酰胺纳滤膜等方面，尚未应用于PVDF膜上，但同时也为后期PVDF膜的酶固定方法研究提供一定的理论依据。

经对比发现，不同类型的酶固定化方法各有千秋，目前还不能明确哪种就是最佳的固定化方法。这需要根据漆酶种类、聚合膜的性能等因素来具体分析。上述几种方法虽然都不同程度地对酶活性造成了影响。但可以肯定的是，大部分固定化技术都可以有效地提高漆酶的稳定性。如何在保证漆酶活性的同时提高漆酶的稳定性将会是酶的膜固定化领域研究的重点。

4 漆酶固定化的PVDF膜在水处理中的应用

酶固定技术可大幅度延长漆酶使用寿命，提高漆酶的耐受性和稳定性，在有毒废水中亦可保持较高活性，在多次处理后可通过化学手段进行酶清洗，实现酶的重装载。针对不同污水应采用不同的载体及固定化方法，该机制可有效地降低成本并减少废水中有毒组分对酶活性的影响。在酶催化氧化过程中底物通常被氧化成自由基或活性中间体，并在自偶联反应下形成二聚体、三聚体，甚至是高聚体[24]，进而通过简单的纯化过滤技术去除。该技术以高效、无二次污染、价格低廉等优点在污水处理领域具有较好的发展前景。

4.1 在含酚废水处理中的应用

酚类化合物污染范围极广，对人体、农作物、水生物等危害极大。目前，含酚废水的处理方法大致分为生物降解、光催化、电催化等3种。酶固定化技术作为一种新型的微生物技术[25-26]在污水处理中备受瞩目。微生物法与传统的物理化学法相比具有催化效率高、简单易控制、不会造成二次污染等优势。而固定化漆酶由于生物密集性高，相比游离态漆酶来说，处理效果更佳。

XU[27]等采用共价键合法将漆酶固定到纳米铜改性的PVDF膜上，经实验发现在pH等于4时，漆酶的固定化效率最佳，可达588 mg·g-1，这种生物催化膜对 2,4,6-三氯苯酚的去除率可达 95.4%。究其原因，可能是漆酶活性中心的电子传递发生氧化还原反应从而将有机污染物降解成自由基，纳米铜的加入加快了氧化还原反应速率，从而提高了有机污染物降解效率。

景伟侯[28]等开发了一种新型的低温水热（LTH）溶胶-凝胶涂层技术，在PVDF膜表面形成薄而坚固的二氧化钛（TIO2）涂层。随后将固定有TIO2的膜片浸泡在配好的漆酶溶液中，使漆酶共价固定在TIO2上。对该制备好的生物催化膜进行BPA（双酚A）去除率检测，结果发现未包覆 TIO2的生物催化膜对BPA去除率为64%左右，在经过3层包覆后去除率可高达85%以上。且经包覆TIO2后的膜在4次降解循环中监测跨膜压力（TMP）没有明显增加，表明经 TIO2包覆的新型生物催化膜对染料废水具有更高降解效率和良好的防污性能。经分析发现TIO2上存在羟基，使漆酶更加牢固地固定在膜片表面，较高的载酶率与酶活性使该膜片表现出更高的BPA降解效率。

4.2 在微量有机污染物去除中的应用

微量有机污染物是指含量少、有毒、难降解的有机污染物。这种污染物来自于地面径流、生活污水以及工业废水的排放，主要分为人工合成有机物（SOC）和天然有机物（NOM）两类，对人体健康有较大的威胁[29-30]。现有的去除办法去除率均较低，难以满足排放标准。

MASJOUDI[31]等采用相位反转法制备了一种PVDF/MWCNT（多壁碳纳米管）纳米复合膜，并利用化学吸附法将漆酶固定。MWCNTs中羧基的存在有效提高了漆酶固定化效率，但漆酶活性有所降低，这可能与固定化过程中漆酶的变性有关。在两种有机农药（卡马西平和双氯芬酸）的去除实验中发现，在4 h内去除27%马西平，48 h内去除95%双氯芬酸。这表明基于PVDF/MWCNT膜固定的漆酶是一种高效的污水处理催化剂。

5 结 论

近年来，酶固定化技术以其独特的优势成为环境治理领域的研究热点，国内外的研究学者开发出一系列的新型酶固定技术，极具应用前景。与此同时，膜分离技术作为一个古老但新兴的技术，经过不断的创新发展，已经被应用于各个领域。膜材料由于其结构的可调性和较高的机械性能，成为备受关注的固定化载体材料。二者的有效结合在环境治理领域有着深远的意义。但该项技术仍存在较大发展空间：

1）目前对于膜前固定漆酶的研究尚处于实验室阶段，如何提高漆酶的存活温度以及找到适宜的溶剂在不形成凝固浴的同时溶解漆酶将成为未来需攻克的难题，同时目前对加入添加剂的非共价修饰研究较为广泛，但是蛋白质工程的定向性与新颖性不可忽视，这将成为未来新的发展方向。

2）现有的几种固定化方法各有利弊，且不同种类的漆酶，不同种类的膜材料，有着不同的固定化方法，这就需要基于大量的实验来验证，无法进行普遍的总结和广泛的应用，或许在今后的研究中可以建立数据库进行收集对比，以便找出最佳固定方案。

3）在几种酶固定化技术中都不可避免地造成酶活性的降低，如何在保证酶活性的同时提高漆酶稳定性将会是未来创新酶固定技术的主要研究方向。

4）目前，漆酶直接固定在PVDF膜上在水处理方面应用较少，但可以采用二次改性的方式对漆酶进行固定，利用纳米铜、TIO2、碳纳米管等新型材料，通过更牢固的化学键合力将漆酶固定，从而提高降解效率。尤其是TIO2的光催化和自净能力亦不容忽视，将其与聚偏乙烯膜结合或许可以制备出一种新型自清洁型生物催化膜。