凉山油橄榄主栽品种叶中营养物质和酚类含量的季节性变化

王碧霞，杜小奇，邓 燕，蔡晓梅，苏光灿

(1.西华师范大学环境科学与工程学院，四川 南充 637002；2.凉山州中泽新技术开发有限责任公司，四川 西昌 615000)

油橄榄(Oleaeuropaea)为木樨科(Oleaceae)木樨榄属(Olea)常绿乔木，原产于地中海沿岸[1]，是我国成功引种的优良木本油料作物。经过50多年的引种栽培，油橄榄对我国的生态环境表现出极大的适应性。四川凉山州是我国油橄榄种植的一级适生区，位于川西高原的安宁河平原腹地，其油橄榄产业发展较快，种植面积达3 330 多公顷[2]。但凉山的生态条件与油橄榄原产地不尽相同，主要呈现出夏雨冬干、干雨季分明的气候特征[3]。尽管我国引种油橄榄已近60 a，关于油橄榄的深度研究仍集中在地中海原产地少数种植国家，对我国独特气候条件下油橄榄的相关研究比较欠缺。最近的研究发现，凉山油橄榄果实中的酚类化合物在果实生长早期增加迅速，然后随着果实成熟开始减少。与来自地中海的油橄榄相比，该地区油橄榄果的水分含量较高，而不饱和脂肪酸和油含量相对较低[4]。油橄榄叶中含有大量的生物活性成分，具有多种药理功效。据文献记载，油橄榄叶在地中海地区用于民间医药历史悠久，能直接用于治疗发烧或疟疾，可预防高血压、高血脂、心血管和糖尿病等[5]。用油橄榄叶研制的茶含有维生素、氨基酸、多酚等活性成分，是国内茶叶中的新兴种类[6]。有证据表明，油橄榄叶的健康益处和潜在的药理作用被归因于其含有的酚类成分[5,7]。但油橄榄叶的酚类成分受品种、气候条件、采样时间、遗传和地理来源等因素的显著影响[8-12]。刘红梅等[6]通过探究油橄榄茶中总多酚、总黄酮和橄榄苦苷的季节变化规律，确定油橄榄茶的最佳采收季节为春季。虽然凉山州的油橄榄叶已被研发成为保健茶，但关于不同品种油橄榄叶片中游离氨基酸、可溶性蛋白、可溶性糖等营养物质和酚类成分季节变化的相关研究鲜见报道。因此，本研究针对凉山州6个主栽油橄榄品种老叶和嫩叶中的主要营养物质及7种酚类成分，运用高效液相色谱法(HPLC)定性和定量分析酚类成分在全年中的季节以及品种间变化，以期获得凉山油橄榄叶的最佳采摘时间和最优品种，为油橄榄叶在药品、保健品和功能性食品等方面的高值化开发利用提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2020年1—12月每月中旬，在四川凉山西昌北河油橄榄基地(102.27°E，27.72°N)采集6个主栽品种叶片，供试油橄榄品种及其种源地分别为：‘卡林’(‘Kalinjot’),阿尔巴尼亚Albania;‘阿斯’(‘Ascolana tenera’)，阿尔巴尼亚Albania;‘皮削利’(‘Picholine’)，法国France;‘戈达尔’(‘Gordal’)，西班牙Spain;‘科拉蒂’(‘Coratina’)，意大利China;‘鄂植’(‘Ezhi’)，中国China。参考Ranalli 等[13]的方法，随机选择每个油橄榄品种12 a树龄的样树3株，在样树不同方位和部位选取2年生枝条，并在同一枝条上采集嫩叶和老叶(嫩叶为枝条新梢顶端嫩绿色的第3～5片发育叶，老叶主要来自靠近枝的分支位置且呈墨绿色的半硬化叶)，另选择‘张林’(‘Zhanglin’)品种的测定数据用于分析季节变化。老叶和嫩叶含水率分别为4.68%和5.51%，将采集的鲜叶用纯水清洗，在45 ℃下干燥至质量恒定，研磨成粉，于4 ℃冰箱保存备用。样树叶片特征如图 1 所示。

1.2 样品制备及指标测定

1.2.1 酚类及营养物质的提取

酚类成分提取：称取1 g油橄榄叶片粉末，以30 mL乙醇(体积分数50%)为溶剂，在50 ℃的条件下240 W超声提取20 min。超声辅助提取后，在4 000 r/min条件下离心10 min，取上清液待用。

营养成分提取：称取0.1 g 油橄榄叶粉加入5 mL水，80 ℃水浴15 min后，5 000 r/min条件下离心 5 min，取上清液用于检测游离氨基酸和可溶性糖含量。然后，制备由 10 mmol/L NaCO3和 10 mmol/L NaHCO3组成的提取液，再配备考马斯亮蓝G-250(CBB)染色液，将10 g CBB溶于5 mL 乙醇(体积分数95%)和10 mL磷酸(体积分数85%)混合液后稀释至100 mL；称取0.25 g 油橄榄叶粉末加入5 mL提取液，超声(240 W、20 ℃)辅助提取 15 min，8 000 r/min条件下离心 5 min，取0.1 mL上清液与0.5 mL CBB染色液反应5 min后用于可溶性蛋白含量的测定。

1.2.2 高效液相色谱(HPLC)分析

根据文献[14-15]的方法，利用高效液相色谱(HPLC)法定性和定量分析油橄榄叶酚类化合物，7种酚类物质分别为橄榄苦苷、芦丁、木犀草素-4′-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素、槲皮素和芹菜素。使用Agilent 1260 HPLC与350 nm的UV-Vis DAD检测器偶联，C18反相柱(5.0 μm，150 mm×4.6 mm)，温度30 ℃，流速0.8 mL/min，注射体积10 μL。橄榄苦苷的检测波长为254 nm，分别以水(75%)和乙腈(25%)作为流动相A和流动相B。其余6种物质检测流动相包含0.2%磷酸水溶液(A)和乙腈(B)。总运行时间33 min，流动相梯度变化为：[A(84%)+ B(16%)]0～3 min；[A(70%)+ B(30%)]3～20 min；[A(60%)+ B(40%)]20～25 min；[A(84%)+ B(16%)]25～30 min；[A(84%)+B(16%)]30～33 min。酚类成分含量(mg/g)=[(C×V)/W]/1 000，其中：C为通过校准曲线计算的每种溶剂中分析物质量浓度,mg/mL；V为样液体积，mL；W为干物质量，g；1 000为稀释倍数。

1.2.3 营养成分的测定

1)游离氨基酸含量(FAAC)采用茚三酮显色法[15-16]测定。首先，取待测样液0.5 mL置于5 mL离心管，加入1.5 mL茚三酮溶液和0.5 mL蒸馏水后，再加入0.05 mL抗坏血酸溶液；将混合液在100 ℃下水浴15 min，立即在冰浴冷却20 min，并在570 nm处测量吸光度。根据标准曲线y=0.046 2x-0.004 9(R2=0.999 6)计算游离氨基酸含量(mg/g)。

2)可溶性糖含量(SSC)采用硫酸苯酚法[16-17]测定。取待测样液100 μL置于5 mL离心管，加入100 μL苯酚溶液和500 μL浓硫酸，将混合物摇匀冷却，室温放置20 min后，于490 nm处测定吸光度。根据标准曲线y=10.110 0x+0.060 8(R2=0.998 2)计算可溶性糖含量(mg/g)。

3)可溶性蛋白含量(SPC)采用考马斯亮蓝法测定[17-18]。取待测样液0.1 mL加入0.5 mL CBB溶液(10 mg考马斯亮蓝G-250溶入5 mL 90%乙醇，再与10 mL 85%磷酸混合，最后用蒸馏水定容至100 mL)，将混合物摇匀放置2 min后于595 nm处测定吸光度。根据标准曲线y=0.296 7x+0.099 2(R2=0.999 6)计算可溶性蛋白含量(mg/g)。

1.3 数据分析

利用Excel 2020和SPSS 19.0进行数据处理，不同季节和品种间的差异分析采用单因素方差分析方法(One-way ANOVA)。数据显示为平均值±标准偏差(mean±SD)，显著性水平设定为α=0.05。所有试验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 油橄榄叶中主要酚类成分的变化

2.1.1 油橄榄叶中的主要酚类成分

根据混合标准品的HPLC色谱图(图2A)，对比确定油橄榄叶中主要酚类成分为橄榄苦苷、芦丁、木犀草素-4′-O-葡糖苷、芹菜素-7-O-葡糖苷酶、木犀草素、槲皮素和芹菜素，图2B为典型月份样品的HPLC图。根据表1中的线性校准范围、相应的校准方程、保留时间和回归系数进行油橄榄叶中酚类化合物的定量分析。

表1 油橄榄叶中酚类成分分析

2.1.2 不同叶龄油橄榄叶中酚类成分的季节变化

油橄榄叶主要酚类成分中，橄榄苦苷和木犀草素-4′-O-葡萄糖苷含量最高，其变化范围分别为4.44～116.87和1.41～51.19 mg/g(表2)，嫩叶中的含量普遍高于老叶，并在春季(1—3月)呈稳定的上升趋势，均在2—3月达到较高值；而进入夏秋季节(4—9月)后，总体含量较低；到冬季(10—12月)时二者又逐渐回升，并在11月的嫩叶中达到较高值。

与橄榄苦苷和木犀草素-4′-O-葡萄糖苷相比，油橄榄叶中芦丁和芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量较低，其值变化在0.01～3.82和0.41～3.19 mg/g的范围内。与老叶相比，嫩叶中芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量在初春时较高，而在春末(3月)时较低，其相对较低的含量一直持续到夏秋季节，直至秋末(9月)开始比老叶的高，并在11月达到极值(3.19 mg/g)。但芦丁含量在冬春季升高，并在1月呈现峰值，除老叶在2、6、12月中含量较高外，老叶和嫩叶在其余月份间含量均无显著差异，并在夏秋季中含量水平同时降低，且波动幅度较小。在所测的主要酚类成分中，槲皮素和木犀草素含量最少，全年含量均低于0.20 mg/g，芹菜素更是低出检测限(表2未列出)。木犀草素含量除5月以嫩叶的高于老叶的外，其余月份中叶龄间的差异不显著,且该化合物在嫩叶中极不稳定，于8月和12月中低于检测限。槲皮素在春季时含量稳定，且嫩叶中的含量普遍高于老叶，但在4—5月和9月未检测到该化合物。由此可见，油橄榄叶中酚类成分受季节和叶龄的显著影响，在不同月份呈现不同的变化趋势，且大多数化合物含量在夏秋季节波动幅度大，而在冬春季节更稳定，且嫩叶中含量相对更高。

表2 不同叶龄油橄榄叶中主要酚类成分含量的季节变化

2.1.3 不同品种油橄榄叶中主要酚类成分的变化

不同油橄榄品种两个叶龄叶片中的酚类化合物含量有差异。‘卡林’、‘戈达尔’和‘科拉蒂’3个品种嫩叶中的橄榄苦苷含量分别为94.38、85.56和65.40 mg/g，不仅高于老叶，也高于其他品种(表3)。‘阿斯’嫩叶中芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量较高(2.58 mg/g)，老叶中较低(1.55 mg/g)，而芦丁、木犀草素-4′-O-葡萄糖苷、木犀草素和槲皮素在叶龄间的差异不显著，其总体水平也较低。‘科拉蒂’嫩叶中芹菜素-7-O-葡萄糖苷(2.69 mg/g)、芦丁(3.71 mg/g)和木犀草素-4′-O-葡萄糖苷(52.57 mg/g)含量均较高，但木犀草素和槲皮素水平却很低；‘皮削利’与之相反，嫩叶中木犀草素和槲皮素相对较高，老叶中橄榄苦苷水平极低。对于‘鄂植’品种嫩叶而言，木犀草素和槲皮素含量均较高，芦丁含量也达到最大值(4.38 mg/g)。

表3 不同品种及叶龄油橄榄叶中主要酚类成分含量分析

在‘卡林’品种酚类成分的季节变化中，没有检测到芹菜素，但在‘鄂植’品种叶片中出现，同时还在‘卡林’和‘阿斯’品种的嫩叶中检测到该化合物。与其他品种相比，‘卡林’嫩叶中芦丁含量较高(4.02 mg/g)，但其他成分则相对较少。木犀草素-4′-O-葡萄糖苷在老叶中较为稳定，尤其在‘鄂植’和‘戈达尔’品种中分别为38.15和49.94 mg/g(表3)。橄榄苦苷在‘戈达尔’嫩叶中极为丰富(85.56 mg/g)，但其他化合物含量居中。从总体上看，虽然‘科拉蒂’、‘鄂植’和‘卡林’的酚类化合物相对丰富且较为稳定，但与老叶相比，嫩叶含量较高。因此，获得丰富酚类成分的较佳品种分别为‘科拉蒂’、‘鄂植’和‘卡林’，可将其嫩叶作为高值化利用的潜在来源。

2.2 油橄榄叶中主要营养物质的变化

2.2.1 不同叶龄油橄榄叶中主要营养物质的季节变化

油橄榄叶片中FAAC、SSC和SPC在1—12月的含量变化见表4，其波动范围(包括老叶和嫩叶)分别为2.92～27.25、4.11～21.23 mg/g和1.43～5.97 mg/g。春季(1—3月)油橄榄叶中3种主要营养成分含量均较高，FAAC含量在2月嫩叶中达到峰值(27.25 mg/g)，SPC含量也在此季节持续增长(3.57～4.62 mg/g)。进入4月后，3种营养物质同时骤降，尤其是FAAC含量降至谷底，但盛夏5—6月却大幅度增加，嫩叶中FAAC含量和SSC含量在6月升至26.80和21.23 mg/g；与之同时，老叶中SPC含量在5月也显著上升(5.97 mg/g)(表4)。进入秋冬季后，油橄榄老叶和嫩叶中营养成分含量逐渐降低，直至12月时，FAAC和SPC含量开始回升。

表4 不同叶龄油橄榄叶主要营养物质含量的季节变化

从全年的变化情况来看，3种营养物质含量均在嫩叶中更高，但在夏季5月时，SPC在老叶的含量比嫩叶上升更显著。由此可见，季节变化对凉山油橄榄老叶和嫩叶中FAAC、SSC和SPC含量的影响极其显著，且获得较多这3种营养物质的采样季节为2—3月和5—6月。另外，油橄榄嫩叶中的营养物质比老叶中更丰富。

2.2.2 不同品种油橄榄叶中主要营养物质组成的变化

6个主栽品种中，‘戈达尔’嫩叶中的FAAC和SPC含量比其他品种的更高，其含量高达47.67和7.34 mg/g，SSC含量则低至8.34 mg/g；‘卡林’嫩叶中含有丰富的SSC和SPC，且FAAC含量也高达42.64 mg/g(表5)。

表5 不同品种及叶龄油橄榄叶主要营养物质含量的变化

而‘鄂植’品种老叶中SPC含量比嫩叶中高19.77%，老叶的SSC和FAAC含量与嫩叶的接近。‘科拉蒂’品种的情况相似，即与老叶相比，嫩叶中SPC含量下降12.35%，SSC在叶龄间的差异不显著，但FAAC在嫩叶中更高。‘阿斯’品种老叶的变化较为有趣，SSC含量是嫩叶中的2.09倍，SPC含量却比嫩叶低11.34%，FAAC含量低至18.94 mg/g。‘皮削利’品种叶片中的3种营养成分均以嫩叶更丰富，但整体水平较低。总体而言，凉山油橄榄6个主栽品种叶片中的FAAC、SSC和SPC含量具有品种间和叶龄间的显著差异，其中‘卡林’、‘戈达尔’和‘鄂植’3个品种的嫩叶营养成分相对稳定且含量较高，可作为油橄榄叶茶的最佳材料来源。

3 讨 论

3.1 季节和叶龄对凉山油橄榄主栽品种叶中酚类含量的影响

油橄榄叶中的活性成分主要受遗传、种源地、采样时间、生长状况和营养状况等多种因素的影响[5,18-19]。Savournin等[20]分析了油橄榄叶中橄榄苦苷、毛蕊花苷、木犀草素7-O-葡萄糖苷等酚类物质含量，结果发现油橄榄叶中4种酚类物质含量在夏季比春季更低。本研究通过HPLC法检测凉山油橄榄老叶和嫩叶中7种酚类化合物，发现具有显著的季节性差异；其中橄榄苦苷和木犀草素-4′-O-葡萄糖苷在春季也呈稳定的上升趋势，而夏秋季节时，橄榄苦苷、芦丁、木犀草素-4′-O-葡萄糖苷和芹菜素-7-O-葡萄糖苷均在4月和9月显著下降，这与Diab等[11]和Wang等[12]的研究结果相吻合。Wu等[2]认为4、6和9月是凉山油橄榄春芽、夏芽和秋芽的发育时期，而1月和11月时叶片接近休眠状态，生长非常缓慢，这将是影响这些化合物含量的重要因素。同时，嫩叶拥有更丰富的酚类成分，如橄榄苦苷在‘卡林’、‘戈达尔’和‘科拉蒂’品种的嫩叶中含量最高，芹菜素-7-O-葡萄糖苷在‘阿斯’品种嫩叶中较高，芹菜素-7-O-葡萄糖苷、芦丁(3.71 mg/g)和木犀草素-4′-O-葡萄糖苷(52.57 mg/g)在‘科拉蒂’品种嫩叶中增加，而‘皮削利’老叶中橄榄苦苷水平极低，表明凉山油橄榄叶中酚类成分具有品种和叶龄差异，这与Savournin等[20]的报道也一致。他们发现芦丁在‘Cayon’和‘Verdale-Picholinehybid’品种中含量最多(≥0.26%)，毛蕊花糖苷含量在‘Aglandau’和‘Lucques’品种中较高(≥0.50%)，芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量在两个品种中都非常高。Ranalli等[13]还报道了油橄榄衰老叶片中主要活性成分的变化，并强调叶片颜色、叶龄和遗传因素显著影响橄榄苦苷的含量，认为可能与遗传特征、种源地等因素有关[21]。

3.2 季节和叶龄对凉山油橄榄主栽品种叶中营养物质的影响

游离氨基酸常用于反映植物体内的氮素代谢情况和植物对氮素的吸收、转运、同化等状况，是蛋白质等含氮化合物合成与分解过程的中介物质[22]。可溶性糖则反映植株的碳素营养代谢状况，是碳水化合物代谢和暂时贮藏的主要形式[23]。本研究通过检测凉山油橄榄叶中FAAC、SSC和SPC含量在全年(1—12月)的含量变化，发现3种营养成分在2—3月和5—6月均显著增加，这可能是植株为更好地抽出新梢和发出新芽，叶片中营养物质增加；也或许是由于春季温度较低，有利于叶片中含氮化合物的合成与积累，其中游离氨基酸和蛋白质等营养物质含量升高[24]。然而，油橄榄在4月进入花芽萌动期后，3种营养物质均显著下降。同时，6个油橄榄品种叶中FAAC、SSC和 SPC含量差异显著，如‘戈达尔’品种嫩叶中拥有较多的游离氨基酸和可溶性蛋白，SSC含量较低，而‘鄂植’和‘科拉蒂’品种老叶中SPC比嫩叶高。另一方面，不同品种叶龄中的营养物质分布也不均匀，如与老叶相比，‘卡林’品种嫩叶中3种营养成分含量都较高。此外，相同品种不同叶龄时其营养成分也不相同。如‘阿斯’品种老叶中SSC含量是嫩叶的2.09倍，SPC含量却比嫩叶低11.34%，FAAC含量低至18.94 mg/g。这表明油橄榄叶中营养物质受到了季节和品种的显著影响，该现象不仅与油橄榄遗传基因有关，还可能与油橄榄树花、芽、果的生长和营养循环紧密相关[9]。

综上所述，凉山地区油橄榄6个主栽品种叶片的FAAC、SSC和 SPC和7种酚类成分在全年不同季节呈不均匀分布状态，其含量在不同品种叶片中波动幅度大，尤其是在老叶和嫩叶中含量差异显著。总体上看，从油橄榄叶中获得丰富的营养物质和稳定的酚类成分的较佳季节为春季，其中3月最为合适；6个主栽品种中，‘鄂植’和‘卡林’叶片中拥有较多的营养成分和酚类化合物，其嫩叶可作为潜在的高值化材料来源加以开发。