松材线虫Bx-HSF-1转录激活活性研究

张瑞芝，姜生伟，吴 昊，陈俏丽, 4，李丹蕾, 3, 4，王 峰, 3, 4*

(1.黑龙江省外来林木病虫害监测与防控重点实验室,东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.辽宁省林业和草原局有害生物防治检疫工作站，辽宁 沈阳 110001;3.辽宁省危险性林业有害生物防控重点实验室，沈阳工学院，辽宁 沈阳 113122;4.森林生态系统可持续经营教育部重点实验室，东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

近半个世纪以来，松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)已在我国19个省(自治区、直辖市)728个县级行政区发生，严重危害我国松林[1-3]。近年来，松材线虫在我国的分布线呈持续快速北移的态势，已突破年均温10 ℃线，扩张至辽宁丹东、抚顺和吉林延边朝鲜族自治州汪清县等地[1，4-5]。松材线虫抗逆态幼虫(third-stage dispersal juvenile，DJ3，或称LⅢ、DL3)可以在低温等不利条件下生存，在松材线虫向东北等低温地区扩张过程中起重要作用[6]。

在模式线虫秀丽线虫(Caenorhabditiselegans)发育过程中，Insulin/IGF(insulin-like growth facter)路径和ILS(insulin-like signal)路径是秀丽线虫形成抗逆态幼虫的关键[7-8]，HSF-1(heat shock transcription factor 1,热激转录因子)在Insulin/IGF路径和ILS过程中起重要作用。Insulin/IGF路径中，DAF(dauer formation)-28经由HSF-1将热激信号传递到DAF-16[9-12]。HSF-1在调节线虫寿命[8]以及线虫生长发育过程[13]中也起着重要作用。当hsf-1被RNA干扰后，会使温度敏感的秀丽线虫幼虫滞育，主要发生在2龄幼虫(J2)向3龄幼虫(J3)转变的过程中[13]。HSF-1还影响ILS对饥饿、热激或激素信号的调节，进而促进抗逆态幼虫形成[8]。

在对松材线虫的研究过程中发现，温度是影响松材线虫分布范围的重要环境因素[14]。温度刺激可诱导松材线虫热激转录因子基因Bx-hsf-1在多数体细胞，尤其是神经元、体壁肌肉细胞和皮下细胞中高表达[15]。生物信息学分析表明Bx-HSF-1具有特异DNA序列结合的分子功能，Bx-HSF-1被预测为转录调控因子[15]。鉴于秀丽线虫hsf-1直接或间接地与ddl-1/2、aap-1、pdk-1及多个daf基因发生调控/互作关系，因此有必要鉴定Bx-HSF-1与其靶基因的调控关系。为进一步确定Bx-HSF-1的功能，本研究鉴定了Bx-HSF-1的转录激活活性，并通过基因沉默和转录组测序筛选出靶基因，分析在7个虫态(龄)中这几个靶基因的表达量变化，为进一步确定Bx-HSF-1在松材线虫各虫态(龄)发育过程中的调控网络提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 线虫

试验所用松材线虫Nxy61株系由中国林业科学研究院提供。松材线虫在灰葡萄孢(Botrytiscinerea)菌苔上25 ℃避光培养，扩繁备用。

1.2 pGBKT7-Bx-hsf-1重组载体构建

参照Bx-hsf-1CDS(coding sequence)序列，合成1对带有SalI、XmaI酶切位点引物，引物序列为：5′-ACTGTCGGTCCCCCC GGGGGGAAT GTC GTA TCT GGA TGG AAA AGA TG-3′，5′-CCATGGACACGCGTC GACGTC GGC CAT AGC GGC CGC GGA ACT AGT AAG GTT GAG TTT CAT ATG TG-3′(下划线为酶切位点，斜体部分为保护碱基)。以松材线虫cDNA为模板，使用该特异引物进行PCR扩增，1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测条带正确后用纯化试剂盒纯化基因PCR产物，-20 ℃保存。

分别对pGBKT7载体和Bx-hsf-1基因PCR扩增纯化产物进行XmaI和SalI-HF限制性内切酶双酶切(37 ℃，3 h)，1%琼脂糖凝胶电泳检测条带正确后，对酶切产物进行纯化。利用T4连接酶连接pGBKT7载体和Bx-hsf-1基因的双酶切产物，4 ℃过夜。将连接产物通过热激转化转入大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α感受态细胞中，在含有卡拉霉素(Kana mycin(50 mg/L)的LB培养基上37 ℃过夜培养，随机挑取阳性单克隆进行PCR检测并测序。根据测序结果选取正确核苷酸序列的单克隆菌液进行37 ℃过夜培养，提取质粒保存于-20 ℃，将其命名为pGBKT7-Bx-hsf-1。

1.3 Bx-HSF-1转录激活活性验证

pGBKT7-Bx-hsf-1和阴性对照pGBKT7分别转入酵母(Saccharomycescerevisiae)AH109感受态细胞。将酵母转化菌株分别滴在不同缺陷型固体培养基(SD/-Trp、SD/-Trp/-His/-Ade和SD/-Trp/-His/-Ade+X-α-gal)上筛选，并以3个不同体积浓度(V菌液∶V生理盐水为1∶1、1∶10和1∶100)滴在SD/-Trp/-His/-Ade缺陷型培养基上，放置在30 ℃下培养2 d拍照。

1.4 Bx-hsf-1 RNA干扰

分别用对Bx-hsf-1基因RNA干扰的羧基荧光素标记siRNA(5′-GCA AUA CUU CAA GCA UAA UAA CUU GAA CAG[dT][dT]-3′)、对照Bx-Actin基因RNA干扰的菁染料标记siRNA(5′-GCC UUC UUU CUU GGG UAU GGA AUC UGC CG[dT][dT]-3′)以及无靶向siRNA(5′-AGG AGC UGU UCA CCG GGG UGG UGC CCA UCC U[dT][dT]3′)进行RNA干扰试验。用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的ddH2O分别稀释相应的siRNA至2 mg/mL(含10 mmol章鱼胺)后浸泡线虫12 h[16]后荧光显微镜拍照记录，RT-qPCR鉴定RNA干扰效果(引物对为Bx-hsf-1-F，GGG GAG GAT TTG GAG ATG ATG G;Bx-hsf-1-R,AAG AGA TGC CCT TCC TTG GC)。使用两步法PCR：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，40个反应循环，60～95 ℃测定溶解曲线。以松材线虫Bx-Actin为内参基因(positive internal control)。相对定量法计算3次重复试验初始模板量比值，两配对样本t检验差异显著性。

1.5 RNAi处理线虫差异表达基因鉴定

分别提取Bx-hsf-1RNAi处理组和对照组(control check，CK)线虫总RNA，经Bioanalyzer 2100(Agilent，CA，USA)检测合格后送深圳华大公司构建cDNA文库并采用Illumina Hiseq平台进行转录组测序。深圳华大公司完成序列拼接和表达量均一化FPKM(fragments per kilobase million)，FDR(false discovery rate)校正(adjustedP-value,公式中记为Padjusted)。根据FPKM，分别统计出RNAi组和CK组松材线虫各基因表达量变化的log2倍数值，公式中记为log2(NRNAi/NCK)，并筛选差异表达基因(differentially expressed genes，DEG)[log2(NRNAi/NCK)<-0.5(Padjusted<0.001)][17]。根据DEG编码蛋白质的分子功能，鉴定这些基因之间的调控路径。

用贝尔曼漏斗法分离收集松材线虫，取J2、DJ3、DJ4、J3、J4、雄成虫(male)和雌成虫(female)，分别提取J2、DJ3、DJ4、J3、J4、雄成虫和雌成虫的总RNA[18-19]。选用GoTaq 2-Step RT-qPCR System Kit，应用Stratagene Mx3000P进行RT-qPCR鉴定6条基因表达量，Bx-daf-21(Bx-daf-21-F.AAA GTT GGC GAG ATC CCC TG;Bx-daf-21-R.CGG CTT CAT CAA GGT CCA GA)、Bx-hsp-1(Bx-hsp-1-F.TGG CAC CAC ATA CTC CTG TG;Bx-hsp-1-R.GGG TTC ATG GCG ACC TGA TT)、Bx-hsp-70(Bx-hsp-70-F.ATC ATT GCC AAC GAC CAG GG;Bx-hsp-70-R.ATC ATT GCC AAC GAC CAG GG)、Bx-sti(Bx-sti-F.CGG AGC TCA CCA GCA CTA TG;Bx-sti-R.CGG CAC GAT GTT CTC TAC CA)、Bx-cdc(Bx-cdc-F.GAC ACC AAG CTC GTC TGG AA;Bx-cdc-R.TCC TTT TCA TCC TGG GTG TTC T)和Bx-hsf-1(引物对Bx-hsf-1-F和Bx-hsf-1-R)在J2、DJ3、DJ4、J3、J4、雌成虫和雄成虫共7种虫态(龄)中的表达量。使用两步法PCR，内参及PCR条件如1.4所述。

2 结果与分析

2.1 Bx-HSF-1转录激活活性验证

利用XmaI和SalI-HF限制性内切酶双酶切pGBKT7和Bx-hsf-1基因克隆纯化产物，得到具有黏性末端的线性pGBKT7载体(图1A-1)和Bx-hsf-1基因片段(图1A-2)。提取连接转化后测序成功的重组质粒DNA(图1A-3)，再将该质粒用XmaI和SalI-HF限制性内切酶双酶切。琼脂糖凝胶电泳后，胶图中有双条带，一条带位于pGBKT7载体位置，另一条带位于Bx-hsf-1基因位置(图1A-4)，说明pGBKT7-Bx-hsf-1重组质粒构建成功。

转有pGBKT7空载体和pGBKT7-Bx-hsf-1重组质粒的酵母菌株均能在SD/-Trp单缺培养基上生长(图1B)，表明pGBKT7空载体和pGBKT7-Bx-hsf-1重组质粒均已成功转入酵母中。转有pGBKT7-Bx-hsf-1重组质粒的酵母菌株在SD/-Trp/-His/-Ade三缺培养基上能够正常生长，而对照组转有pGBKT7空载体的酵母菌株在三缺培养基上不能生长(图1B)，表明Bx-HSF-1能够激活下游报告基因的表达；pGBKT7-Bx-hsf-1重组质粒的酵母菌株在SD/-Trp/-His/-Ade+X-α-gal培养基上显蓝色(图1B)，表明在酵母体内Bx-HSF-1能够激活mel1基因(α-半乳糖苷酶基因)表达，水解X-α-gal产生蓝色底物，证明Bx-HSF-1在酵母体内具有较强的转录激活活性。

2.2 Bx-hsf-1 RNA干扰

经siRNA过夜浸泡后，Bx-hsf-1的表达被有效抑制。荧光显微观察表明,羧基荧光素和菁染料标记的siRNA均被松材线虫有效吸收(图2A、图2C 2和图2C 4)。RT-qPCR结果显示，在siRNA浸泡12 h后松材线虫的Bx-hsf-1和Bx-Actin没有相互干扰，Bx-Actin可作为内参基因，Bx-hsf-1在松材线虫中被显著抑制表达[log2(NRNAi/NCK)=-1.86，P<0.01，n=3](图2B)。在Bx-ActinsiRNA和非靶向siRNA处理松材线虫12 h后，Bx-hsf-1的表达量并无显著差异。经过10 d试验研究，与CK组线虫相比，Bx-hsf-1RNAi处理的线虫存活率和形态(图2A和2C)均无显著差异(P=0.46)。

2.3 RNAi处理线虫差异表达基因鉴定

综合RNAi处理组和CK组松材线虫转录组测序结果，筛选出DEG 110条。表达量显著下调基因86条[log2(NRNAi/NCK)<-1，Padjusted<0.001，P<0.01，图3A蓝色五角星]，去除表达量显著下调的Bx-hsf-1[log2(NRNAi/NCK)=-1.745，Padjusted<0.001，P<0.01]，鉴定到靶基因85条(Padjusted<0.001，P<0.01，图3A)，包括：具有肌动蛋白结合活性的Bx-anc、微管运动活性相关的Bx-che、4个线虫表皮结构成分蛋白基因Bx-col、热激蛋白基因Bx-hsp-70、半乳糖凝集素同源基因Bx-lec、负向调节身体形态发育和生长的Bx-lon以及幼虫发育和正向调节基因Bx-lrp等多个与线虫生长、幼虫发育和温度应激相关基因。另有表达量显著上调基因24条[log2(NRNAi/NCK)>1，Padjusted<0.001，P<0.01，图3A红色五角星]，其中包括Insulin/IGF路径中与Bx-daf-16、Bx-daf-2和Bx-gld互作的基因，以及与蜕皮周期相关的MLT-10样蛋白编码基因和参与细胞代谢的Bx-dct基因。

对DEG进行基因互作分析，110条DEG中有46条基因构成133对直接调控关系(图3B)，放大到3级调控层次，其中37条基因构成以Bx-daf-21(图3B 19)为中心的一个多级调控网络，Bx-HSF-1直接调控Bx-daf-21，并通过热激蛋白70基因[Bx-hsp-70，log2(NRNAi/NCK)=-1.109，Padjusted<0.001，P<0.01，图3B 24]间接调控Bx-daf-21。此外，Bx-hsf-1还与Bx-hsp-1(图3B 58)、胁迫诱导基因Bx-sti(图3B 57)，以及Bx-DAF-21结合蛋白基因Bx-cdc(图3B 59)发生互作关系。

2.4 7个虫态(龄)中差异表达基因表达量鉴定

对分离出的J2、DJ3、DJ4、J3、J4、雄成虫和雌成虫进行显微拍照(图4A)。RT-qPCR测定Bx-daf-21、Bx-hsp-1、Bx-hsp-70、Bx-sti、Bx-cdc和Bx-hsf-1共6条基因在J2、DJ3、DJ4、J3、J4、雄成虫和雌成虫共7种虫态(龄)中的表达量(图4B)，Bx-hsf-1在DJ3、J3和J4中显著下调，其他虫态(龄)未发生变化。RT-qPCR结果显示Bx-daf-21在DJ3、J3和J4中显著下调；Bx-hsp-1仅在DJ4和雌成虫中上调表达；Bx-hsp-70在DJ3、J3、J4、雄成虫和雌成虫中显著上调；Bx-sti在7个虫态(龄)中均无明显变化；Bx-cdc在DJ3、雄成虫和雌成虫中显著上调。以上结果表明Bx-daf-21与Bx-hsf-1表达量变化趋势一致，Bx-hsp-70与Bx-hsf-1表达量变化趋势相反。

3 讨 论

转录因子HSF-1介导的热激反应是一种保守生存机制，其作用是维持蛋白质稳态[20]。目前为止发现的大多数HSF-1靶基因都编码热激蛋白(heat shock protein，HSP)，保护细胞免受蛋白质破坏剂的破坏[21]。除了hsp基因外，HSF-1还调控参与多种细胞过程的基因，包括细胞保护、发育、代谢和衰老。秀丽线虫HSF-1不仅在热激反应中起着核心作用，同时还调控线虫生命活动、寿命、虫龄及相关生理过程[13, 22]。本研究对松材线虫Bx-HSF-1进行研究发现，Bx-HSF-1在酵母体内具有转录激活活性，是一个转录激活因子。由于Bx-HSF-1为转录调控因子，转录因子发生较小的变化，就会引起调控网络中其他基因剧烈的变化[17]，所以通常将转录因子及microRNA等调控因子的log2(表达量阈值)<-0.5定义为下调，log2(表达量阈值)>0.5定义为上调[17, 23]。

松材线虫是一类通过媒介昆虫迁移的植物寄生线虫，不同于其他植物线虫，其发育阶段在其生命周期中具有明显的阶段特异性作用[24]。先前对松材线虫致病性的研究过程中，主要以混合虫态(龄)进行研究[25]，很少关注不同虫态(龄)之间的差异。近期有研究表明，松材线虫各虫态(龄)在寄主植物内有相同的生态位，但在松材线虫各虫态(龄)有许多差异表达基因[18-19, 26]。RT-qPCR结果表明Bx-hsf-1在松材线虫不同虫态(龄)中的表达量存在差异。与Bx-hsf-1相关的Bx-daf-21、Bx-hsp-1、Bx-hsp-70、Bx-sti、Bx-cdc这5个靶基因变化幅度都较大。Bx-hsp-70在不同虫态(龄)中的表达量变化趋势与Bx-hsf-1相反，与秀丽线虫中热激反应衰减期间HSP-70负调节hsf-1转录[27]相符。本研究中Bx-daf-21仅在DJ3、J3与J4龄期显著下调，其他虫态(龄)变化幅度较小，与Bx-hsf-1表达量变化趋势一致。Bx-daf-21基因是热激蛋白90基因(hsp-90)的同源基因，又名Bx-hsp-90，以往研究表明该基因沉默会降低不适温度下松材线虫的存活率[16]。daf-21在秀丽线虫形成DJ3过程中起关键作用[28]。RT-qPCR结果表明，在DJ3龄期Bx-daf-21与秀丽线虫daf-21的表达量变化趋势相同[28]，这意味着Bx-daf-21有可能在DJ3龄期起作用。本研究还发现Bx-daf-21、Bx-hsp-1、Bx-hsp-70、Bx-sti、Bx-cdc和Bx-hsf-1在不同虫态(龄)中表达量存在差异，为进一步研究松材线虫的发育过程及其调控机理提供基础。