生防菌盾壳霉对油菜根际土壤微生物群落结构的影响

杨潇湘，黄小琴，张 蕾，张重梅，鲜赟曦，周西全，刘 勇

（1四川省农业科学院植物保护研究所，成都 610066；2农业农村部西南作物有害生物综合治理重点实验室，成都 610066）

0 引言

由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)侵染危害造成的油菜菌核病在中国油菜种植区域普遍发生，常年株发病率为10%～30%，严重年份达80%以上，致使油菜减产10%～70%[1-2]。据国家油菜产业技术体系调查，中国每年仅长江流域因该病所造成的损失超过20亿元。因此，解决油菜菌核病威胁对保障油菜生产至关重要。在农作物病害防治策略中，应用抗病品种是病害防治最为安全环保、高效的措施，但目前生产上没有菌核病抗病种质资源可以利用。当前化学农药防治为油菜菌核病的主流防治措施，然而菌核病危害巨大，防治药剂多数成本较高，因化学农药长期使用导致抗药菌株的产生和环境污染等问题也日益严重[3]。为此，发展环境友好型的有益微生物防治措施势在必行。盾壳霉(Coniothyrium minitans)作为核盘菌的重寄生真菌，能够寄生和杀死核盘菌的菌核和菌丝，降低油菜菌核病的初侵染源和再侵染，在菌核病的生物防治中具有广阔的应用前景[4-6]。然而，大量外源生防微生物被人为添加至土壤环境中，极有可能导致土壤中原有微生物的群落结构和生态功能等遭到破坏[7]。因此，有必要研究生防微生物施用后对土壤微生物群落结构的影响。前人研究结果表明，生防微生物除了通过菌株自身直接的作用来发挥生物防治功效，还可通过改善根际土壤微生物群落结构、提高土壤有益菌的丰度和多样性、降低病虫害的发生和危害、改善土壤环境、增加土壤养分、实现土壤保育，提高作物品质等方面，利于农作物的可持续健康发展[7-10]。前期工作中，本课题组分离获得1株对核盘菌具有强寄生效果的盾壳霉菌株Cm2004，其油菜菌核病生防效果显著。本研究拟进一步评价盾壳霉Cm2004菌株对土壤微生物群落的影响，明确其是否能改善土壤环境。基于此，本研究通过田间试验研究盾壳霉Cm2004对油菜菌核病的防治效果和高通量测序分析其对油菜根际土壤微生物群落结构的影响，为生防微生物的安全使用及评价提供重要理论依据，以期通过生防微生物的施用改善土壤微生态环境，保障油菜可持续安全生产。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试生防菌盾壳霉菌株Cm2004，由四川省农业科学院植物保护研究所油菜病害研究室分离获得。‘川油36’是由四川省农业科学院作物研究所选育而成的油菜品种。

1.2 研究区概况

研究区位于四川省绵阳市安州区塔水镇浮萍村，地理坐标为 31°27′51.63″N，104°25′13.71″E，海拔为555.20 m。该地属亚热带湿润季风气候，具有气候温和、雨量充沛、日照充足、四季分明等特征。多年平均气温16.3℃，年平均日照时数1058.7 h，年平均降水量1261 mm。

1.3 油菜菌核病调查和根际土壤采集

试验设置喷施盾壳霉区和清水对照区2个试验区域。用清水将本课题组制备的盾壳霉Cm2004分生孢子制剂稀释成106个/mL，在油菜苗期间隔10天喷施2次(450 L/hm2)，以清水喷施为对照。在最后一次喷施30天后进行土壤样品采集。在每个区域选取距离10 m以上的3个呈三角形的采样点，根据5点取样法将油菜挖出并抖落根部附着的疏松土壤，收集与油菜根系紧密结合的土壤并混匀成一个土壤样品，经2 mm筛后于-80℃冰箱冷冻暂存[11]。

在油菜成熟期进行菌核病病害调查，每个处理按土壤采集方式选择3个调查点，每个调查点以5点取样法随机选取50株，分别调查油菜菌核病病株数，并进行发病情况定级。根据调查结果计算油菜菌核病的病情指数和防效[1]。

1.4 土壤总DNA提取、PCR扩增及高通量测序

土壤DNA提取采用试剂盒E.Z.N.A®.Mag-Bind®Stool DNA Kit(OMEGA)进行，DNA定量和提取质量分别采用Nanodrop 2000(Thermo Scientific)和琼脂糖凝胶电泳检测。

细菌的16SrDNA的V4区域采用引物515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和 806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')[12]进行扩增，真菌rDNA的ITS1区域采用引物ITS1-1737F(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')和ITS2-2043R(5'-GCTGCGTTCTTCAT CGATGC-3')[13]进行扩增。PCR产物经过纯化回收、质量检测合格后委托北京诺和致源科技有限公司执行建库及测序工作。

1.5 高通量测序数据分析

原始测序序列经Trimmomatic软件质控后，根据97%的相似度采用Uparse软件将其聚类成为OTUs[14]。OTUs物种注释分析采用Qiime软件与数据库Unit进行，并统计在各分类水平上的群落组成[15-16]；Rarefaction分析采用Mothur方法进行[17]；稀释曲线利用R软件制作并评估各样品在测序强度间的差异；α-多样性指数，包括Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数通过Qiime软件计算，并评估序列文库的多样性。

2 结果与分析

2.1 生防菌盾壳霉Cm2004对油菜菌核病的防治效果

由表1数据可知，清水对照区域(CK)的油菜菌核病发病较严重，病株率和病情指数分别高达74.64%和46.13；而喷施盾壳霉区域(CM)的菌核病发病较轻，病株率和病情指数分别降低至23.33%和9.37，防治效果明显，病指防效达79.70%。说明盾壳霉Cm2004可以有效防控油菜菌核病，生防效果显著。

表1 盾壳霉对油菜菌核病的防治效果

2.2 高通量测序数据预处理结果

稀释曲线一般用于评估微生物组测序量或样本量的饱和情况，由图1可知，随着测序数据的增加，细菌和真菌的稀释曲线斜率平滑、变化较小、趋于平缓，说明测序量已充足。覆盖度(Coverage)用于评估结果是否符合真实情况。盾壳霉处理(CM)和对照组(CK)的细菌和真菌覆盖度分别为98.8%和99.7%、98.7%和99.7%（表2），说明本研究的测序结果较符合油菜根际土壤真实的细菌和真菌群落。CM和CK产生的细菌和真菌OUT数分别为2176和653、2194和544，表明喷施盾壳霉对真菌OUT数影响较大。此外，CM土壤真菌的ACE指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数均大于CK（表2），表明盾壳霉的施用增加了土壤真菌群落丰富度和多样性比例。

图1 油菜根际土壤细菌和真菌的稀释曲线

表2 土壤细菌和真菌丰度和微生物多样性

2.3 施用盾壳霉对土壤细菌群落结构的影响

细菌门水平群落结构分析结果显示（图2）：相对丰度大于1%的优势菌门从多到少依次为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和酸杆菌门(Acidobacteria)。施用盾壳霉会使变形菌门和芽单胞菌门相对丰度比例增加，但会降低放线菌门的相对丰度。

图2 细菌门水平的物种相对丰度

在细菌属水平上（图3），含量最多的前10种依次是鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、unidentified_Chitinophagace-ae、寡养单胞菌 (Stenotrophomonas)、罗河杆菌属(Rhodanobacter)、 溶杆菌属 (Lysobacter)、Stenotrophobacter、Paeniglutamicibacter、独岛菌属(Dokdonella)、假单胞菌(Pseudomonas)和地杆菌属(Geobacter)。施加盾壳霉能显著增加鞘脂单胞菌属、溶杆菌属和独岛菌属等的相对丰度，会显著降低unidentified_Chitinophagaceae、寡养单胞菌和地杆菌属等的相对丰度。

2.4 施用盾壳霉对土壤真菌群落结构的影响

在门水平上（图4），相对丰度大于1%的优势菌门依次是油壶菌门(Olpidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)和担子菌门(Basidiomycota)。施用盾壳霉后会子囊菌门、被孢霉门、担子菌门等丰富度比例均增加。

图3 细菌属水平的物种相对丰度

图4 真菌门水平的物种相对丰度

在真菌属水平上（图5），含量最多的前10种依次是油壶菌属(Olpidium)、梭孢壳属(Thielavia)、短梗蠕孢属(Trichocladium)、镰刀菌属 (Fusarium)、耐干霉菌(Xeromyces)、Cutaneotrichosporon、Apiotrichum、曲霉属(Aspergillus)、Plectosphaerella和被孢霉属(Mortierella)。施加盾壳霉可增加短梗蠕孢属、镰刀菌属、曲霉属、Plectosphaerella等属的丰富度，会显著降低梭孢壳属和Cutaneotrichosporon的相对丰度。

图5 真菌属水平的物种相对丰度

3 讨论与结论

盾壳霉作为植物病原真菌核盘菌的重寄生真菌，在油菜菌核病的生物防治中具有较好的应用前景。然而，生防菌盾壳霉的施用必然会导致大量外源真菌被添加到土壤环境中，对油菜根际土壤原有微生物群落结构的影响尚不明确。本研究凭借高通量测序技术分析盾壳霉Cm2004施用后土壤微生物群落结构的变化。结果表明：喷施盾壳霉Cm2004不仅可以有效防控油菜菌核病，还可改善油菜根际土壤微生物群落结构。

土壤微生物群落丰度和微生物多样性常采用ACE指数、Chao1指数、Shannon指数等来表征，其数值的高低可以揭示土壤微生物种类和功能的差异[18-19]。一般来讲，指数越高，微生物种类或数量越丰富。本研究喷施盾壳霉菌株Cm2004后，油菜根际土壤真菌的ACE指数、Chao1指数、Shannon指数均高于对照组，表明施加盾壳霉提高了油菜根际土壤真菌群落的丰富度和多样性比例，使油菜田土壤真菌群落向稳定和多样化方向发展，这与祝静等[10]添加木霉菌肥对土壤真菌微生物群落结构的影响一致。而土壤细菌的这些指数变化不明显，说明外源盾壳霉施用后对土壤原有细菌没有胁迫作用，不会造成原有土壤细菌微生物群落结构的改变。

土壤微生物种群数量和群落组成与植物病害的发生密切相关。生防微生物的应用一方面可通过菌株自身的直接作用发挥生防效果，另一方面还可通过改变土壤微生物群落结构影响植物病害的发生[7]。本研究发现，盾壳霉的施用可以增加一些有益微生物的种群丰度。在门水平上，喷施盾壳霉使得土壤中变形菌门和子囊菌门的相对丰度比例增加。这与PANG等[20]和祝静等[10]在番茄和玉米根部喷施生防真菌得到的结果相似。很多变形菌门的细菌在平衡周边环境和有效促进植株对土壤养分的吸收利用方面起着至关重要的作用。子囊菌门的真菌多为腐生真菌，起着降解有机质的重要作用。此外，施加盾壳霉还会促进担子菌门相对丰度的增加，土壤中担子菌门真菌可促进土壤物质分解、循环，大多为土壤有益微生物[10]。在属水平上，施加盾壳霉可增加鞘氨醇单胞菌属、溶杆菌属、曲霉属等属的丰富度。鞘氨醇单胞菌属菌大都具有生物降解的能力，可以产生被利用的高分子聚合物，除了常用于秸秆腐熟、改良土壤结构和增加土壤养分外[21-23]，还可以用于植物病害的生物防治[24]。溶杆菌属细菌是一类重要的微生物资源，大都具有典型的溶菌活性，可以抑制多种病原真菌、细菌的生长，杀灭病原线虫，还能诱导植物抗性，增强抗病能力[25]。曲霉属真菌在农业生产中用处广泛，可以用于秸秆腐熟，利于土壤中营养成分含量的提高，还可以降磷，具有开发成溶磷生物菌剂的潜力。曲霉属真菌的代谢产物还可以防治植物线虫和水稻白叶枯病等，在生物防治领域的应用潜力巨大[26-28]。因此，笔者推测盾壳霉菌株Cm2004可以有效防治油菜菌核病的原因也包含有两方面。盾壳霉的施用一方面可以寄生腐烂土壤里的核盘菌菌核，大大减少菌核病的初侵染源；另一方面喷施盾壳霉可以改善土壤微生物结构，增加土壤有益微生物的丰度，从而减轻病原菌的侵染与危害。此外，笔者发现盾壳霉处理和对照土壤中均存在大量油壶菌属真菌（根肿菌按照旧版的分类系统，属于油壶菌属真菌）[29]，这与我们田间调查发现油菜根肿病较为严重的结果一致。

综上，施用盾壳霉Cm2004可以增加土壤真菌种群丰度和多样性比例，改善土壤微生物群落结构，提高有益菌含量，对油菜菌核病的防效高达79.70%。研究结果明确了生防菌盾壳霉施用后对土壤微生物群落结构的影响，为该生防菌的田间大面积推广应用提供了重要理论依据。