无创产前基因检测筛查胎儿性染色体异常的临床意义

黄素珍 朱平 刘萍 胡文香 付秀梅 黄仁英 胡莉琴

江西省赣州市妇幼保健院妇产科，江西赣州 341000

预防和减少出生缺陷一直是优生优育的重要目标，选择精准的产前筛查和产前诊断方法是重要内容，既往多羊水穿刺，细胞培养的结果作为产前筛查及诊断的金标准，但样本采集过程会对孕妇造成损伤且具有流产风险，孕妇的接受度不髙[1]。研究发现，孕妇血浆中存在胎儿游离DNA，可以此为突破点开展新的产前筛查途径[2]。随着科学技术的进步，二代测序技术得到改善，无创产前基因检测技术不仅在胎儿13-三体综合征、18-三体综合征、21-三体综合征等情况中的准确率较高，其检测性染色体准确性也较高[3]。本研究选择不同年龄段孕妇，统计并分析其羊水核型中性染色体非整倍体的发生率及妊娠结局，探究孕妇年龄与胎儿性染色体非整倍体发生风险之间的关系。本研究选取赣州市妇幼保健院妇产科的17 561例孕妇作为研究对象，分析无创产前基因检测筛查胎儿性染色体异常的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性选取赣州市妇幼保健院妇产科2018年1月至2019年12月因孕妇高龄、产前筛查高风险、有不良孕产史及超声发现胎儿结构异常或软指标异常胎儿等原因需要进行无创产前基因检测筛查的17 561例单胎孕妇作为研究对象，孕妇年龄18～44岁，平均（32.32±4.34）岁；孕龄12～20周，平均（16.22±2.28）周。经无创产前基因检测发现，共有93例性染色体异常高风险孕妇。按照年龄将孕妇分为四组，即<30岁组（7 916例）、30～<35岁组（4 274例）、35～<38岁组（3 048例）、≥38岁组（2 323例）。<30岁组：年龄18～<30岁，平均（23.12±1.44）岁；孕龄15～20周，平均（17.76±1.43）周；体重指数18.00～26.45 kg/m2，平均（23.33±2.17）kg/m2。30～<35岁组：年龄30～<35岁，平均（32.56±0.52）岁；孕龄14～21周，平均（17.04±1.55）周；体重指数18.42～27.01 kg/m2，平均（23.10±2.05）kg/m2。35～<38岁组：年龄35～<38岁，平均（36.11±0.11）岁；孕龄15～21周，平均（17.32±1.32）周；体重指数18.44～27.22 kg/m2，平均（23.04±2.11）kg/m2。≥38岁组：年龄38～44岁，平均（41.11±0.45）岁；孕龄13～20周，平均（17.22±1.18）周；体重指数18.39～26.89 kg/m2，平均（23.01±2.05）kg/m2。四组研究对象的孕龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。纳入标准：①孕妇个人资料以及临床检查资料完整；②可正常交流沟通；③同意接受产前检查；④患者对本研究内容知情同意；⑤均为健康女性，无其他合并症。排除标准：①合并妊娠糖尿病或者妊娠高血压疾病；②合并恶性肿瘤疾病；③血液系统疾病；④依从性差。本研究经医院医学伦理委员会审核批准（批准文号：201504）。

1.2 方法

DNA提取：使用EDTA抗凝管（北京依珊汇通科技有限公司提供）采集孕妇5 ml外周静脉全血，在4℃、1 600g的环境中进行离心处理（速度：3 000 r/min，半径：16 cm），时间为10 min。取血浆后在同一条件下再次离心10 min。使用半导体测序通过在半导体芯片的微孔中固定DNA链，DNA聚合酶以单链DNA为模板，按碱基互补原理，合成互补的DNA链。每延伸一个碱基时，就会释放一个质子，引起酸碱环境的变化，感知层检测酸碱值变化，并将化学信号转换成数字信号，动态判断碱基。并通过对所有测序信号的分析实现对DNA序列各个位点不同碱基的相对定量，及DNA片段的序列判断[4]。基因测序仪BioelectronSeq 4000（博奥生物集团与美国Thermo Fisher公司合作研发）的测序原理为使用半导体测序通过在半导体芯片的微孔中固定DNA链，DNA聚合酶以单链DNA为模板，按碱基互补原理，合成互补的DNA链。DNA链延伸一个碱基便有一个质子释放，改变酸碱环境，感知层检测酸碱值变化，并将化学信号转换成数字信号，动态的判断碱基。并通过对所有测序信号的分析实现对DNA序列各个位点不同碱基的相对定量，及DNA片段的序列判断[5]。

测序数据分析：测序结束后，采用经CE-Markr认证的罗氏Harmony无创产前检测分析软件进行分析，获取样本X以及Y染色体的Z值，由此判断样本的检测结果[6]。

羊水细胞培养和核型分析：对无创产前基因测序提示性染色体非整倍体异常患者，在知情且签署同意书的情况下开展后续操作，严格遵守无菌操作原则，通过超声引导定位，采集腹羊膜腔穿刺抽取羊水20 ml，并将羊水样本送至遗传实验室进行常规羊水细胞培养，根据国际人类细胞遗传学命名体系（ISCN2009）进行核型分析及计数，以羊水细胞核型验证结果为金标准，计算阳性预测值[7]。

1.3 观察指标及评价标准

①统计性染色体非整倍体异常产前筛查诊断情况。②统计不同年龄组胎儿性染色体异常情况并判断孕妇年龄与胎儿性染色单体的关系。③无创产前基因检测胎儿性染色体异常结果及羊水细胞核型验证结果。阳性预测值=真阳性例数/（真阳性+假阳性）例数×100%。比较无创基因筛查不同年龄孕妇的胎儿性染色体异常、胎儿性染色体嵌合体及结构异常妊娠结局分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，多组率的两两比较采用Bonferroni方法校正，检验水准为0.05/6=0.008，即以P＜0.008为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 性染色体非整倍体异常产前筛查诊断检出情况

17561 例单胎孕妇，经胎儿性染色体异常统计羊水染色体核型分析检出胎儿性染色体非整倍体共87例（4.95‰），其中45，X、47，XXX（包括48，XXXX）、47，XXY（包括48，XXYY）和47，XYY分别为44、18、19、6例，发生率分别为2.51‰、1.02‰、1.08‰、0.34‰。

2.2 孕妇年龄与胎儿性染色单体的关系

<30岁、≥38岁组的单体45，X总检出率与三体相应年龄组检出率比较，差异均无统计学意义（χ2=0.244、1.146，P＞0.05），30～<35岁、35～<38岁组单体45，X总检出率与三体相应年龄检出率比较，差异有统计学意义（χ2=4.178、5.344，P＜0.05）。年龄35～<38岁、≥38岁的胎儿45，X发生率低于<30岁组，年龄35～<38岁的胎儿45，X发生率低于30～<35岁组，差异有统计学意义（P＜0.008）。35～<38岁、≥38岁组胎儿性染色体三体总发生率高于<30岁组，差异有统计学意义（P＜0.008）；≥38岁组47，XXX发生率高于30～<35岁组，差异有统计学意义（P＜0.008）；35～<38岁、≥38岁组47，XXY发生率高于<30岁组，差异有统计学意义（P＜0.008）；各组间胎儿47，XYY发生率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。87例胎儿性染色体数目异常高情况中，18例为47，XXX高危[其中6例为母体47，XXX高危（占比33.33%）]。<30与30～<35岁组的单体45，X、三体整体检出率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 无创基因检测不同年龄段孕妇的胎儿性染色体非整倍体的检出率[n（‰）]

2.3 无创产前基因检测胎儿性染色体异常结果及羊水细胞核型验证结果分析

45，X、47，XXX、47，XXY、47，XYY阳性预测值分别为92.31%、88.89%、88.89%、75.00%（表2～5）。

表2 胎儿45，X性染色体异常结果及羊水细胞核型验证结果分析（例）

表3 胎儿47，XXX性染色体异常结果及羊水细胞核型验证结果分析（例）

表4 胎儿47，XXY性染色体异常结果及羊水细胞核型验证结果分析（例）

表5 胎儿47，XYY性染色体异常结果及羊水细胞核型验证结果分析（例）

2.4 无创基因筛查不同年龄孕妇的胎儿性染色体异常、胎儿性染色体嵌合体及结构异常妊娠结局分析

非高龄组为12 190例，高龄组为5 369例，非高龄组、高龄组胎儿性染色体异常的引产分别为17例、6例，胎儿性染色体嵌合体及结构异常的引产分别为4例、6例（表6～7）。

表6 无创基因筛查不同年龄孕妇的胎儿性染色体异常妊娠结局（例）

表7 无创基因检测胎儿性染色体嵌合体及结构异常妊娠结局分析（例）

3 讨论

随着生育政策的改变，越来越多的家庭开始计划生育二孩、三孩，高龄孕产妇人数也越来越多，年龄越大，生育的风险越高，因此孕妇越来越重视年龄对胎儿的影响，逐渐重视产前筛查[8-9]。胎儿性染色体非整倍体检测是判断胎儿是否处于健康状态的一种方式，但关于孕母年龄与其发生风险是否存在明显的相关性还未明确[10]。通过二者关系的确定能在一定程度上预测胎儿性染色体非整倍体的发生风险，且可帮助各年龄层的孕产妇进行合理的产前筛查与产前诊断，达到优生优育的目的[11]。

本研究结果显示，35～<38岁、≥38岁组的胎儿45，X发生率低于<30岁组，35～<38岁组的胎儿45，X发生率低于30～<35岁组，差异有统计学意义（P＜0.008）；35～<38岁、≥38岁组47，XXY发生率高于<30岁组，≥38岁组47，XXX发生率高于30～<35岁组，35～<38岁、≥38岁组胎儿性染色体三体总发生率高于<30岁组，差异有统计学意义（P＜0.008）；各组间胎儿47，XYY发生率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。提示胎儿45，X、47，XXY、47，XXX等染色体异常情况与孕妇年龄存在一定关系，这一研究结果与黄芬芳等[12]研究结果相符。性染色体异常数目、结构两种异常，以上异常情况会损伤对胎儿生理结构或功能，因此，产妇在进行产前筛查时应该重视对胎儿性染色体非整倍体的相关检测，可保障胎儿的健康状态，以免造成家庭的负担[13-14]。但35～<38岁、≥38岁组中并未显示孕妇年龄越高，47，XXY发生率越高，可针对这一年龄阶段的孕妇进行更深入的研究，确定47，XXY发生与年龄是否有关。本研究结果显示，年龄35～<38岁、≥38岁的胎儿45，X发生率低于<30岁组，但其发生胎儿性染色体三体异常风险较高，其发生概率与年龄并未表现出清晰的线性关系。侯亚萍等[15]研究显示年龄越高，孕妇的胎儿发生45，X的发生率越高，相关性分析显示r=0.321，P=0.012，提示年龄与胎儿45，X发生率存在一定相关性，这一研究结果与本研究不相符，可能是因为本研究选择的样本质量或者样本数量不佳，可进行更进一步的研究。本研究选择不同年龄段孕妇作为研究对象，而不是仅限于高龄产妇（年龄>34岁），因此胎儿性染色体非整倍体检测的结果更具科学性，能相对准确地反映两者的关系[16-17]。与实际情况相比，本研究中性染色体非整倍体发生率更高，可能是本研究未能排除部分影响因素，例如孕产次、伴偶年龄等，且本研究的研究对象较少，未来需要进一步扩大样本量，同时对研究对象进行随访。

根据不同年龄以及是否合并胎儿先天畸形的胎儿性染色体异常的孕妇进行分析，为孕妇提供选择妊娠结局的科学依据，性染体数目或结构异常均可导致不同程度的性征发育异常，从而影响胎儿生长发育，例如性器官发育不全会引起胎儿性分化异常，导致胎儿出现生殖器官以及其他脏器发育不全、身体及智力发育障碍等情况[18-19]。但如未合并其他脏器的严重先天畸形，除大多数无生育功能外，仍可以像正常人一样生存，因此，通过无创基因检测基因筛查出胎儿性染色体异常在染色体核型结合超声诊断下慎重选择是否终止妊娠，为产前咨询，产前诊断提供适宜的工作指导意见[20-21]。同时，通过无创基因检测可对孕妇进行警示，使其更关注产后新生儿的生长发育情况，尽早发现并接受治疗，同时加强心理辅导。但是本研究无创产前基因筛查对象的较少，筛查结果可能缺乏客观性，与实际情况有所偏差，因此建议一进步更大样本量的研究。

综上所述，筛查胎儿性染色体异常时采用无创产前基因检测的准确率较高，但鉴于其高假阳性，该方法仅可作为一种高级筛查性检测方法，但不能作为确诊方法。该技术具有较高的临床应用价值和发展前景，但其准确性还有待提高，筛查阳性病例需要通过进一步用传统的侵入性产前诊断确诊。