左金丸治疗幽门螺杆菌感染研究进展

龚汶，赵宁宁，祁月英

(河北省沧州中西医结合医院，河北 沧州 061000)

审因论治是中医治疗策略的重要组成部分，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是临床胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病的重要病因。经过30余年的努力，中医在治疗Hp方面积累了丰富的经验，也开展了很多基础及临床方面的研究。左金丸出自《丹溪心法》，由黄连、吴茱萸按照6∶1的比例组成，辛开苦降、寒热并用，可清热泻火，降逆止呕，是临床常用方剂，也是临床治Hp感染使用频率较高的方剂；体外、体内研究均提示左金丸有很强的抑杀Hp的作用。本文综述左金丸治疗Hp的基础、临床及机制研究，为其在治疗Hp的临床应用提供依据。

1 Hp感染与脾胃湿热证

中医无Hp的概念，临床研究发现Hp感染者中湿热体质占比最多[1]。辛辣饮食及肥甘厚味是脾胃湿热证的原因，Hp可通过饮食传染，与生冷饮食相关性大；从临床表现看，Hp感染者存在口臭、腹胀、腹痛等症状，症状多反复发作，而中医脾胃湿热证患者亦可见上述症状，舌红苔黄腻，病程长，缠绵难愈，二者极其相似。Hp感染患者脾胃湿热证居多[2]，约90%的脾胃湿热证患者存在Hp感染[3]，清热利湿、清热解毒是Hp治疗中使用频率较高的治法，黄连等清热解毒药物使用频率也很高[4]，脾胃湿热证Hp感染者13碳呼气试验DOB值多大于35[5]，因而Hp与中医脾胃湿热相关性非常大。湿热是中医胃肠疾病的重要病因，已经有研究提示肠道湿热与肠道微生态密切相关[6]；脾胃湿热是胃病的重要病因及证型，某种程度上反映胃部微生态变化；Hp感染引起慢性胃炎患者口腔牙菌斑、舌苔中存在Hp，是胃部感染的重要来源[7]，Hp感染引起慢性胃炎患者多表现为黄苔，口腔Hp可能与梭菌共聚存在[8]；Hp在胃部定植是否也与梭菌共聚存在目前无相关研究。有研究提示芽孢杆菌仅存在于慢性胃炎患者的黄色舌苔中，慢性胃炎患者舌苔与胃液中存在大量简明弯曲杆菌与胃癌前病变相关[9]。所以，脾胃湿热证能更多反映胃部微生态状态，包括Hp感染，但不仅限于Hp。我们对胃部微生态的认识仍然有限，Hp只是目前研究明确的致病菌，Hp在人体胃部定植后通过不同机制引起胃部一系列炎症变化，可导致非萎缩性胃炎、萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃癌等不同的临床疾病，患者也多因胃脘胀痛等消化不良症状就诊。而大多数Hp感染者可无症状，只能依靠呼气试验等检测发现。临床中可借鉴仝小林院士[10]的“靶态因果”诊疗模式，将呼气试验检测值视为脾胃湿热证的微生态标靶，其结果高低可反映脾胃湿热程度，这样便将70%无症状Hp感染者也纳入中医治疗体系，这种认识既有利于我们在清热利湿类药物中筛选Hp敏感药物，也可以借鉴实验研究及药理实验成果寻找靶药回归临床。

2 左金丸抑制Hp研究

2.1 左金丸及黄连、吴茱萸抑制Hp的体外研究

多篇文章[11-22]报道了Hp敏感中药的筛选，主要是体外抑菌实验，多采用(K-B纸片或海绵或打孔琼脂)扩散法和稀释法分别研究中药对Hp的抑菌圈及最低抑菌浓度(MIC)，其中黄连(生药浓度1 g/mL)抑菌圈直径在25～50 mm范围，MIC在0.015 62～25 mg/mL范围，归属于高敏感药物，抑菌圈及MIC不同可能与黄连有效成分提取方式(水煎、乙醇提取、水煎后乙醇提取等)不同有关，也与Hp菌株不同有关[22]。有研究[11]比较了黄连与相同含量的小檗碱针对Hp的抑菌圈及MIC，黄连抑制Hp作用强于小檗碱，所以小檗碱是黄连抑制Hp的主要成分，巴马汀等生物碱也有协同作用。体外研究吴茱萸水煎剂抑菌圈大小，将其归属于中度敏感药物[23]，但张云玲[24]研究吴茱萸乙醇提取物发现相同浓度下吴茱萸抑菌圈(55.24 mm)远远大于黄连(35.23 mm)，该研究进一步揭示了吴茱萸抗Hp有效成份是吴茱萸次碱、柠檬苦素及4种喹诺酮类生物碱。吴玉梅等[25]采用纸片扩散法研究黄连、吴茱萸及其不同配比的乙醇提取物对Hp的抑菌圈大小，黄连和吴茱萸6∶1(左金丸)抑菌圈最大。周红祖等[26]采用琼脂稀释法研究黄连、吴茱萸及其不同配比的配方颗粒及水煎液对Hp的MIC的影响，其中左金丸抑制Hp作用最强，其效果共煎液明显优于配方颗粒，左金丸MIC范围为0.2～3.125 mg/mL[27]。这些研究为左金丸治疗Hp感染提供了初步的实验依据。

2.2 左金丸治疗Hp的动物实验

余惠旻等[27]将Hp感染小鼠分为左金丸高剂量组5.794 88 g/(kg·d)、中剂量组2.897 44 g/(kg·d)、低剂量组1.448 72 g/(kg·d)，连续8周灌胃给药，结果3组Hp清除率分别为80%、30%、50%，与对照组有统计学差异，高剂量组小鼠胃小凹见少量Hp。左金丸对小鼠体内Hp抑制作用呈剂量相关性，为左金丸治疗Hp临床研究提供基础，更为左金丸临床选量提供了依据，但此实验中剂量组清除率反而低于低剂量组，应增加样本量进一步验证。按照动物与人体每公斤体重剂量折算，一个60 kg成人左金丸高剂量相当于左金丸生药38.5 g(黄连33 g,吴茱萸5.5 g)，中剂量相当于生药19.12 g(黄连18 g,吴茱萸3 g)，低剂量相当于生药9.56 g(黄连9 g,吴茱萸1.5 g)，按照ITT分析根除率小于80%为不可接受，所以临床研究应优先选择高剂量左金丸[28]。小鼠实验还可进一步研究左金丸治疗Hp的剂量阈和治疗窗，准确的量效剂量范围、中位剂量、阈剂量等参数及绘制疗效曲线将极大的促进左金丸治疗Hp的临床研究及临床应用[29]。

2.3 左金丸治疗Hp临床研究

以“左金”为关键词可检索出很多文献，但多为左金加味方或联合三联、四联药物使用，很少单独使用左金丸治疗Hp感染。左金加味方或合方中，中药9～13味，治疗总剂量在90～117 g，但黄连、吴茱萸用量均很小[30-32]。陆永才给予Hp感染者左金丸6 g口服,2次/日，相当于动物实验的低剂量，疗程14日，停药4周后复查胃镜活检染色评估疗效，根除率64.7%[33]。《伤寒论》《金匮要略》中黄连日用量范围为13.8～55.2 g[34]，近现代医家黄连日用量在1～120 g不等[35]，仝小林院士[36]认为黄连可清热燥湿调菌群，用量多为15～30 g，因而高剂量左金丸中黄连用量符合中医临床实践，左金丸中配伍辛温的吴茱萸，既能佐制黄连苦寒伤胃，又能提高临床疗效，可以开展高剂量左金丸治疗Hp的临床研究；减少药味、增加用量的精方策略也有利于左金丸治疗Hp机制的探索[37]。

3 左金丸有效成分及体内代谢研究

钱平等[38]分析左金丸的乙醇提取物，新发现6种生物碱、4种柠檬苦素类化合物，分别来源于黄连、吴茱萸，说明左金丸助溶或转化促进了这些物质的发现，这也就是左金丸抑制Hp强于黄连、吴茱萸单药的原因。多项研究[39-40]提示黄连经吴茱萸炮制或黄连吴茱萸配伍后，黄连代表成份小檗碱含量下降了，这也部分解释了王怡薇等动物实验结果，吴茱萸抑制黄连抗Hp代表成份巴马汀、小檗碱的吸收，该实验还证实黄连吴茱萸能够相互促进各自有效成份的肝脏摄取，这与黄雪君等的研究结果基本一致，不同配比的黄连吴茱萸，以左金丸中黄连吴茱萸有效成份吸收效果最好，药物吸收部位可能在小肠[41]。涂瑶生等[42]研究提示左金丸在各个肠段均能吸收，空回肠更易吸收。王怡薇等[43]研究发现吴茱萸能够抑制黄连抗Hp代表成份巴马汀、小檗碱的胆汁排泄，黄连能够抑制吴茱萸中具有抑制Hp作用的代表成份吴茱萸次碱的胆汁排泄。高崇佳[44]研究了不同配伍黄连、吴茱萸灌胃后有效成份在小鼠全身组织均有分布，但胃肠组织分布量多，其中左金丸有效成分胃中分布浓度高。这些基础研究使我们对左金丸的药物代谢有了更多认识，也为我们理解、探索左金丸治疗Hp机制提供了帮助。

4 左金丸治疗Hp的机制研究

文献报道黄连具有抑制细菌DNA与蛋白合成、破坏细菌结构、干扰细菌代谢等机制抑制Hp；吴茱萸可通过抑制Hp呼吸作用发挥抗Hp作用[45]。左金丸及黄连、吴茱萸还可通过多种途径抑杀Hp。

4.1 抑制尿素酶活性

Hp能产生活性很强的尿素酶，尿素酶水解尿素可产生氨和碳酸，氨可以中和胃酸，这为Hp提供接近中性的环境，有利于Hp在胃部的定植与生存；碳酸可清除Hp的杀菌效应物，有利于Hp的生存。而氨与水平衡后产生氢氧化氨，可直接损害组织，尿素酶也是Hp的重要抗原，可通过激活细胞免疫、趋化作用、中性粒细胞呼吸爆发作用等多种机制导致胃黏膜炎症损伤。Hp感染引起的病理变化及胃十二指肠疾病与尿素酶密切相关[46]。谈丽华研究发现黄连的主要成分小檗碱、药根碱、巴马汀、表小檗碱、黄连碱均有抑制Hp及Hp尿素酶的作用，其中表小檗碱作用于巯基活性基团，抑制尿素酶活性最强，黄连碱还可以作用于镍离子从而抑制尿素酶，不同生物碱可抑制尿素酶的不同活性位点，其作用机制可互补增效，抑制尿素酶活性是黄连抑制Hp的重要机制，但黄连碱、小檗碱抑制Hp作用最强，这也提示黄连抑制Hp存在其它机制[47]。吴茱萸、左金丸对Hp尿素酶的影响目前尚无研究，但左金丸以黄连为主药，可以推测抑制尿素酶活性是左金丸抑制杀灭Hp的重要机制之一。

4.2 抑制生物膜合成

在机体内外，Hp均能形成生物膜，Hp以生物膜状态与浮游状态存在，生物膜状态存在的Hp对抗生素的耐受性是浮游状态的1 000倍[48-50]。Hp生物膜是由Hp分泌的胞外多糖基质(EPS)黏附形成排列紧密的细菌体，由蛋白质、糖类成分及胞外DNA组成。生物膜是由基因与环境共同决定的，具有特定结构与功能协调性的动态生态系统，可以通过密度感应系统传递信号以适应环境、提高生存能力。Hp生物膜周围可形成抗原抗体复合物，造成机体持续慢性炎症。生物膜是形成Hp慢性感染的重要原因，也是产生耐药的重要原因，其具体机制有：①EPS的物理屏障作用使人体吞噬细胞无法杀灭生物膜内Hp；②EPS可吸附部分抗菌药物，也可水解灭活抗菌药物；③因为缺乏营养与氧气，Hp生物膜深层菌常处于休眠状态，对抗生素不敏感，停药以后深层Hp繁殖可形成新的生物膜产生抗生素耐药；④Hp生物膜常包涵多个菌株，不同菌株之间可进行基因传递，使下一代Hp有更强的毒性及生存能力；⑤Hp生物膜内外排泵表达升高也是Hp耐药的重要机制[51]。黄衍强体外研究发现黄连的主要成分小檗碱对耐药Hp有抑制作用，在小于50% MIC时仍能明显抑制生物膜的形成，可能与小檗碱引起Hp多糖分泌减少有关[52]。我们推测以黄连为主药的左金丸也可抑制Hp生物膜，但目前尚无相关研究报告。

4.3 调节胃部菌群

普通人胃部存在众多细菌，并形成了胃部微生态，其优势菌门为放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门，优势菌属为链球菌属[53]，魏舒纯等[54]复习了国内外文献指出，作为胃部微生态的一部分，Hp感染会影响胃部微生态，胃部微生态也会影响Hp；轻型链球菌可诱导Hp球变，抑制其生长，乳酸杆菌也能抑制Hp。崔祥等研究提示黄连水煎提取物可在体外抑制肠杆菌、肠球菌生长，而对乳酸菌、双歧杆菌有促进作用，该效应与药物浓度正相关[55]；顾宁宁等[56]的小鼠实验也证实黄连水煎提取物可多维度调节肠道菌群结构，抑制有害菌，同时促进有益菌。蔡锐等研究Hp感染小鼠胃内菌群，发现经戊己丸(黄连、吴茱萸、芍药)治疗，小鼠胃内双歧杆菌和乳酸杆菌菌群数量显著增加[57]，左金丸不但可以直接抑杀Hp，还可通过调节胃内微生态间接抑杀Hp，其机制是益生菌代谢产生的抗细菌物质如过氧化氢、有机酸、细菌素等可抑制Hp的代谢生长或毒素产生，抑制Hp黏附；益生菌的生物屏障作用可抑制Hp的定植[47]。王圆圆等[58]总结乳酸杆菌抑制Hp的可能机制如下：①乳酸杆菌的代谢产物干扰Hp能量代谢，抑制其生长；②乳酸杆菌通过竞争胃上皮细胞，抑制Hp黏附；③乳酸杆菌可抑制Hp尿素酶活性，减少了氨等致病因子的产生。

4.4 左金丸miRNA研究的新方向

近年来miRNA与Hp感染及相关疾病的研究逐渐增多。付伟等使用GEO数据集对比Hp阴性及阳性患者资料，得到42个Hp感染相关miRNA，这些miRNA与调控的靶基因并非一一对应，miR-153-5p、miR-95-5p、miR-577、miR-548-5p、miR-519e-5p等均调控多个靶基因，这些靶基因可能参与Hp的定植和持续感染[59]。Matsushima等[60]对比Hp非感染者，发现Hp感染者胃黏膜有50多个miRNA不同，其中多个miRNA与胃黏膜炎症显著相关，miRNA-223可高敏感、高特异性诊断Hp感染。Hp定植于胃黏膜上皮会引起免疫反应，这有助于机体清除Hp，但几乎所有Hp感染者都存在慢性活动性胃炎，Hp感染可引起miRNA-155、miRNA-146等表达上调，通过不同通路抑制了炎症因子的释放，使Hp逃避机体免疫应答，从而造成胃黏膜慢性活动性炎症[61]。尹作静等[62]研究发现小檗碱和吴茱萸碱按比例使用可产生协同抑制肝癌细胞BEL-7402增殖的作用，阐明了药物组合是以miRNA为核心的网络机制起效，说明黄连、吴茱萸组合有效成分可能通过影响miRNA表达达到治疗目的，我们推测左金丸根除Hp可能存在其有效成分干扰miRNA表达的类似机制。植物中药中miRNA主要通过胃吸收进入机体发挥作用，这也拓展了我们对中药的认识，除了化学成份，miRNA等小分子可能也是中药的有效成分[63]，左金丸中存在哪些miRNA需要进一步检测？某些miRNA可能影响人体免疫反应促进Hp的根除。

4.5 左金丸治疗Hp分子网络调控机制

陈新怡通过中药系统药理学数据库和分析平台分析左金丸抑制杀灭Hp的PPI网络得到IL2、IL4、IL10、VEGFA、TP53、MMP9等多个关键基因靶点，并通过干预细胞增殖、分化、凋亡、炎症反应等多条通路起作用。该研究还筛选出左金丸中吴茱萸碱、小檗碱、巴马汀、吴茱萸次碱等30多个活性成分，其中槲皮素是黄连和吴茱萸共有成分，能作用于143个靶点[64]。文献提示槲皮素存在多种中草药中，具有抗氧化、抗肿瘤、抑制炎症反应及抗菌作用，可以抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠球菌、沙门菌等多种细菌，但槲皮素抑制杀灭Hp无相关报道，有待深入研究[65]。左金丸中多种成分通过多个靶点、多条通路协同作用，最终起到抑制杀灭Hp的作用。以活性成分—基因靶点—信号通路为核心的分子网络调控研究有助于明确左金丸治疗Hp的机制。

Hp位于胃黏液层下面，并且在胃黏膜上皮细胞表面定植，目前所使用的四联药物中铋剂可以穿越胃黏液层直接作用于Hp，而抗生素及PPI均是有效成分吸收入血后起效[28]。左金丸口服可调节胃内菌群，属于局部作用，分子网络调控机制提示左金丸治疗Hp效应靶点及信号通路与左金丸入血的有效成分高度相关，可以肯定左金丸有效成分肠道吸收入血后起到抑杀Hp的作用。左金丸有效成分能否穿透胃黏液层直接作用于Hp目前无相关研究。

5 总结

目前四联方案疗效确定，是Hp治疗首选，但临床仍有许多反复西药根除失败者、抗生素过敏者、药物不能耐受者、基础病较多的高龄患者均需要治疗，并且中国Hp感染人口庞大，中医药是Hp治疗的有益补充[66]。左金丸是临床使用较广泛的方剂，也是Hp治疗潜在的靶方，我们需要整合目前基础研究的知识，梳理临床研究的不足，改进临床研究，检验基础研究的成果，从而使左金丸基础研究与临床研究相互促进。这样有利于中医临床疗效的提高，有利于左金丸抑杀Hp的推广使用，更有利于左金丸抑杀Hp机制研究。