儿童H3K27M突变型胶质瘤病理分子机制及靶向药物研究进展

邓后亮，李亚冰，杨金连，魏媛怡，梁倩莹，何艳玲

(1.广州市妇女儿童医疗中心药学部，广州 510623； 2.广东省妇幼保健院药学部，广州 510010)

胶质瘤是儿童中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，也是儿童最常见的肿瘤相关致死性疾病，根据病理组织学特征及恶性程度可将其分为低级别(世界卫生组织Ⅰ～Ⅱ级)和高级别(世界卫生组织Ⅲ～Ⅳ级)两大类。儿童低级别胶质瘤大多进展缓慢，而高级别胶质瘤恶性程度极高，患儿大多预后不良，5年生存率低于1%[1]。儿童与成人胶质瘤的病理机制截然不同，导致其对目前的标准治疗不敏感，这是儿童胶质瘤预后差的关键原因。然而，2012年该领域获得了一个突破性发现，即大部分儿童高级别胶质瘤患者携带的组蛋白H3第27位赖氨酸被甲硫氨酸替代(histone H3 lysine to methionine substitution on position 27，H3K27M)，其主要特征为编码组蛋白H3的基因H3F3A或HIST1H3B发生突变[2-3]。H3K27M突变是儿童高级别胶质瘤重要的分子生物学基础。虽然在研究早期已经明确了H3K27M突变型胶质瘤的发生发展与多梳蛋白抑制复合体2(polycomb repressive complex 2，PRC2)活性被抑制而导致细胞H3K27三甲基化(H3K27 trimethylation，H3K27me3)修饰等表观遗传调控异常密切相关，但目前对H3K27M突变影响胶质瘤细胞生物学过程以及基因表达的研究仍处于快速发展时期。此外，近年来鉴定出多种在实验室水平具有潜在靶向治疗H3K27M突变型胶质瘤的药物。现就儿童H3K27M突变型胶质瘤病理分子机制及靶向药物研究进展予以综述，以为后续深入研究提供基础。

1 儿童H3K27M突变型胶质瘤概述

组蛋白是核小体的重要组成部分，与维持染色质结构和调控基因表达相关。在哺乳细胞中，组蛋白H3存在多种变异体，包括H3.1、H3.2、H3.3、CENPA、H3.4、H3.5、H3.X和H3.Y等[4]。儿童H3K27M突变型胶质瘤的主要亚型为H3.3K27M和H3.1K27M，该发现于2012年被首次报道[2-3]。其中，Wu等[2]报道高达78%的弥漫性内生型脑桥胶质瘤以及22%的胶质母细胞瘤的患儿携带H3K27M突变。与此同时，Schwartzentruber等[3]研究发现大约36%的儿童胶质母细胞瘤中存在H3K27M突变。后续国内外众多研究进一步证实了儿童高级别胶质瘤中存在高频度的H3K27M突变[5-7]。H3K27M突变型胶质瘤发生部位具有较强的特异性，主要发生于中枢神经系统的脑干、丘脑及脊髓等部位[8]。除了儿童，近年来研究发现少部分年轻的成年胶质瘤患者同样携带H3K27M突变[9]。与非突变患儿相比，H3K27M突变型胶质瘤患儿的预后往往更差[10]。由于H3K27M突变型胶质瘤表现出不同的分子机制以及预后的差异，2016年世界卫生组织的中枢神经系统肿瘤分类第四版修订将H3K27M突变型弥漫性中线胶质瘤单独归为一类[11]。

2 儿童H3K27M突变型胶质瘤病理分子机制

2.1H3K27M突变导致细胞表观遗传调控异常 组蛋白可接受甲基化、乙酰化、磷酸化等多种翻译后修饰，这些修饰与基因表达关系密切，是表观遗传调控的一种重要方式[12]。H3K27既可被甲基化也可以被乙酰化，其中H3K27me3介导的基因转录抑制是基因沉默的标志；而H3K27乙酰化(H3K27 acetylation，H3K27ac)则与基因激活密切相关[13]。目前鉴定出多种表观遗传调控因子催化或去除H3K27me3修饰，其中PRC2负责催化H3K27me3[14]。PRC2由多梳家族蛋白构成，在哺乳细胞中该复合体由Zeste基因增强子同源物(enhancer of Zeste homolog，EZH)1/2、胚胎外胚层发育蛋白、Zeste 12同源物1抑制因子2三种核心蛋白构成，其中EZH1/2具有甲基转移酶活性。PRC2抑制基因表达与H3K27me3修饰密切相关，目前的主流观点认为是胚胎外胚层发育蛋白与染色质上已存在的H3K27me3修饰结合，继而EZH1/2三甲基化邻近核小体的H3K27修饰，最终促使H3K27me3修饰在染色质上的延伸而沉默基因[14]。研究表明，PRC2表达异常及其介导的H3K27me3修饰紊乱引起的细胞基因表达谱的改变与胶质瘤发生发展关系密切[15]。

H3K27M突变发生在可被修饰的位点，大量证据表明H3K27M突变降低细胞H3K27me3修饰整体水平，继而改变细胞基因表达谱[16-18]。Lewis等[16]报道，H3K27M突变型胶质瘤细胞中H3K27M含量只占细胞H3的3%～17%，然而H3K27me3修饰整体水平却显著低于非突变型，且在不同细胞中表达的H3K27M均会引起H3K27me3修饰水平的显著下降。体外酶促反应显示，H3K27M多肽可以显著降低PRC2活性及其介导的H3K27me3修饰水平[16]。该研究还发现，H3K27M可以与EZH2的SET结构域结合，而该结构域是EZH2发挥甲基转移酶活性所必需的。以上结果表明，H3K27me3修饰水平降低不仅由于该位点不能被修饰，更有可能是该突变体具有“dominant-negative”功能，通过与EZH2的SET结构域结合抑制PRC2活性，从而导致细胞中具有活性的PRC2减少。此外，有学者成功解析了PRC2的空间立体结构，并进一步明确H3K27M突变抑制PRC2活性，他们发现与野生型相比，H3K27M突变与PRC2的结合能力更强，而且突变型和野生型与PRC2结合的平衡解离常数相差10倍之多[19]。值得注意的是，虽然H3K27M突变显著降低细胞H3K27me3修饰的整体水平，但它会增加染色质局部区域H3K27me3修饰水平[20]。基于以上证据，H3K27M突变改变H3K27me3修饰可能由于其与EZH2结合使PRC2富集在染色质特定区域，继而PRC2在染色质上的延伸受到抑制，导致细胞H3K27me3修饰整体水平下降以及染色质局部区域H3K27me3修饰水平的升高。

已知H3K27既可以被甲基化，同时也可以接受乙酰化，而且这两种修饰在调节基因表达上存在相互拮抗作用。研究发现，H3K27M突变会引起细胞H3K27ac修饰水平整体升高，导致靶基因激活[16,21]。然而，目前尚不清楚H3K27ac修饰增加是由于H2K27位点的甲基化水平下降还是H3K27M突变影响了相关的乙酰化酶和(或)去乙酰化酶。除了影响H3K27位点的修饰外，H3K27M突变同样可导致DNA低甲基化[18]。DNA低甲基化可影响染色质的稳定性而驱动肿瘤的发生发展，这或许也是H3K27M突变造成基因表达紊乱继而促进胶质瘤发生发展的分子机制之一。

综上所述，H3K27M突变发挥原癌作用与其扰乱H3K27me3和H3K27ac修饰以及DNA甲基化等表观遗传调控密切相关。

2.2H3K27M突变对胶质瘤细胞生物学过程的影响 由于H3K27M突变对多种表观遗传调控有全局性的影响，该突变可能对多种细胞生物学过程有重要影响。截至目前，学者从多层次、多角度证实了H3K27M突变可调控多个与肿瘤密切相关的生物学过程。

2.2.1H3K27M突变对细胞增殖的影响 细胞异常增殖是胶质瘤发生最为突出的特征之一。H3K27M突变在体外能够促进人来源的神经前体细胞的增殖[22]。H3K27M突变促进细胞增殖可能与其沉默细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p16INK4A密切相关[23]。研究发现，H3K27M突变通过调控p16INK4A启动子区H3K27me3修饰和DNA甲基化水平沉默其表达。然而，有研究显示H3K27M突变对儿童胶质瘤细胞周期和增殖并没有影响[24]。这可能由于研究过程中使用的细胞种类不同造成H3K27M突变对细胞增殖的影响结果不一致。

2.2.2H3K27M突变对细胞代谢的影响 代谢改变是癌症的普遍标志特征之一，肿瘤细胞更倾向于吸收和代谢葡萄糖和谷氨酰胺以此维持其关键的生物合成过程。Chung等[25]报道，H3K27M突变可能会引起细胞能量代谢紊乱。该研究的体外、体内实验结果均显示，H3K27M突变增加胶质瘤细胞糖酵解、谷氨酰胺代谢和三羧酸循环等代谢水平以及伴随α-酮戊二酸产生的增加，而将H3K27M突变细胞中能量代谢相关的关键酶，如谷氨酸脱氢酶、己糖激酶 2、异柠檬酸脱氢酶1敲降或抑制后，细胞增殖被显著抑制。基于上述研究结果，靶向能量代谢酶可能是有效的治疗策略。

2.2.3H3K27M突变对胶质瘤干细胞的影响 胶质瘤干细胞是胶质瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞，对胶质瘤的存活、增殖、转移及复发有重要作用。B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒插入位点1(B-cell specific Moloney murine leukemia virus integration site 1，BMI1)是胶质瘤干细胞的标志蛋白之一，对维持胶质瘤干细胞自我更新不可或缺。Balakrishnan等[26]发现，BMI1表达水平及其催化的组蛋白H2A第119位赖氨酸单泛素化修饰水平在H3K27M突变型胶质瘤中上调；体外实验显示，H3K27M突变通过降低BMI1启动子区组蛋白H3K27me3修饰水平而激活其表达，而敲降或抑制BMI1可降低H3K27M突变型胶质瘤细胞自我更新能力。

2.2.4H3K27M突变对上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影响 EMT是由上皮细胞表型向间质细胞表型转化的生物学过程，其异常往往导致中枢神经系统无法正常发育。Sanders等[27]利用生物信息学系统性分析已公开发表的相关数据库，发现儿童H3K27M突变型胶质瘤表达异常基因富集于EMT过程；进一步研究发现，H3K27M突变可上调EMT关键转录因子蜗牛家族转录抑制因子1以及下调Twist相关蛋白1的表达。蜗牛家族转录抑制因子1和Twist相关蛋白1分别是EMT启动和完成的标志蛋白，上述研究结果提示，H3K27M突变可能会阻滞细胞停留在EMT的初始阶段，造成细胞无法顺利完成EMT，这使得细胞分化受阻，细胞处于一种可增殖的干细胞状态，最终导致肿瘤的发生发展。

2.2.5H3K27M突变与其他基因突变的相互作用 研究发现，儿童H3K27M突变型胶质瘤患者中同时存在其他基因的突变[3,28]。虽然目前普遍认为，H3K27M突变是儿童高级别胶质瘤发生的初始启动突变，然而该突变可能与其他基因的改变协同促进肿瘤的发生和发展。p53是细胞中重要的抑癌基因，它的突变或缺失均可促进胶质瘤发生发展，而大部分儿童H3K27M突变型胶质瘤中存在p53基因的突变[3]。α地中海贫血伴智力低下综合征X连锁(alpha thalassemia retardation syndrome X-linked，ATRX)基因编码染色体重塑蛋白，其表达缺失可影响H3.3与着丝粒区和端粒区异染色质的结合，导致染色体结构损害、基因组不稳定以及发生端粒延长替代机制，造成端粒的异常延长，使肿瘤细胞获得无限增殖的能力，最终引发癌变。研究发现，ATRX基因突变与H3K27M突变存在重叠[3]。此外，酪氨酸激酶信号通路的关键蛋白往往在H3K27M突变型患者中被激活，如血小板源性生长因子受体α[3]。另外，转化生长因子(转化生长因子-β)超家族受体激活素A受体1蛋白，可激活骨形态发生蛋白/转化生长因子-β信号通路，而在儿童胶质瘤患者中H3K27M突变与激活素A受体1基因突变存在较高的关联性[28]。上述这些基因突变或表达异常往往与肿瘤发生发展有关，提示它们或许与H3K27M突变有一定程度的交互作用。

目前有研究初步探讨了上述设想。如Pajovic等[29]发现，H3K27M突变型转基因小鼠形成血液肿瘤和癌症的概率大幅增加，但是并未发现胶质瘤的形成，然而联合p53缺失，小鼠即可自发形成胶质瘤。有研究表明，单独H3K27M突变可促进细胞增殖和细胞迁移侵袭能力，但是对细胞恶性转化并没有明显影响，而进一步敲降p53并激活血小板源性生长因子受体α表达，能更大程度地促进细胞增殖，并使细胞获得肿瘤表型[22]。另有研究发现，将H3K27M突变以及p53和ATRX基因敲降的小鼠神经祖细胞移植到小鼠颅内，即可形成肿瘤，而在此基础上再过表达血小板源性生长因子受体α则可缩短肿瘤形成所需要的时间[30]。上述研究表明，H3K27M突变型胶质瘤的发生可能不是H3K27M单一突变造成，而是该突变与其他基因突变或改变共同作用的结果。

3 儿童H3K27M突变型胶质瘤靶向药物

目前，临床治疗儿童H3K27M突变型胶质瘤的标准方案仍是参照成人的治疗方案，主要包括手术、放疗和化疗，但最终的结局仍不理想。在研究人员不懈的努力下，近年来发现多种药物在实验室显示出良好的抗H3K27M突变型胶质瘤效果，这为将来有效治疗H3K27M突变型胶质瘤提供了可能性。

3.1表观遗传药物 H3K27me3修饰异常是H3K27M突变促进胶质瘤发生发展的基础，研究发现逆向改变H3K27me3修饰是一个很有潜力的治疗策略[20,31]。Hashizume等[31]报道，H3K27去甲基化酶家族成员含十字形结构域蛋白3抑制剂GSKJ4可以恢复H3K27M突变肿瘤细胞H3K27me3修饰水平，并能特异性抑制H3K27M突变肿瘤细胞增殖和克隆形成，且抑制肿瘤细胞在小鼠体内成瘤的能力。另有研究发现，EZH2抑制剂(GSK343和EPZ6438)通过调控p16INK4A抑制H3K27M突变胶质瘤细胞在体外和体内的生长[20]。

研究表明，参与调控组蛋白H3K27ac修饰的蛋白也是一类很有前景的药物靶点[32-33]。JQ1是BET(Bromodomain and Extra Terminal domain)的抑制剂，它能降低胶质瘤细胞H3K27ac修饰水平，并抑制H3K27M突变型胶质瘤细胞增殖以及促进细胞分化，且上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p21和细胞分化标志蛋白(微管蛋白β3和微管相关蛋白2等)的表达[32]。Grasso等[33]的研究显示，多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂体外和体内均显示出较好的抗儿童胶质瘤活性。其中，美国食品药品管理局已批准上市的用于治疗多发性骨髓瘤的药物帕比司他抗H3K27M突变型胶质瘤活性最强，可增加肿瘤细胞死亡以及减少细胞增殖，而且还发现帕比司他可下调与肿瘤细胞增殖密切相关基因MKI67 和CCND1的表达。目前该药物正在儿童胶质瘤患者中进行Ⅰ期临床试验(NCT02717455)。

3.2细胞周期抑制剂 p16INK4通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4和6阻止细胞进入S期，而p16INK4是H3K27M突变促进胶质瘤细胞增殖的关键下游基因。研究发现，细胞周期蛋白依赖性激酶4和6特异性抑制剂帕博西尼能够有效阻止H3K27M突变细胞进入S期，而且不影响非突变细胞周期[23]。另有研究发现，细胞周期蛋白依赖性激酶7抑制剂THZ1可以减少H3K27M突变型胶质瘤细胞增殖和增加细胞凋亡[34]。THZ1具有良好的血脑屏障透过性，通过静脉注射时脑实质可达到的浓度远高于其抗癌所需浓度。体内实验发现，尾静脉注射THZ1可显著抑制胶质瘤原位移植小鼠肿瘤的生长，并明显延长模型小鼠的中位生存期[34]。而且，THZ1与其他潜在的治疗药物具有良好的抗H3K27M突变型胶质瘤协同作用，如JQ1和帕比司他。

3.3肿瘤免疫治疗药物 免疫治疗药物主要包括免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)和肿瘤疫苗等。有研究发现，双唾液酸神经节苷脂2(disialoganglioside 2，GD2)在H3K27M突变型胶质瘤细胞中高表达，而GD2特异性CAR-T细胞可独立产生γ干扰素和白细胞介素-2，并能在体外特异性杀伤肿瘤细胞；H3K27M突变型胶质瘤原位移植小鼠尾静脉注射抗GD2 CAR-T细胞后，小鼠颅内仅残留极少数不表达 GD2 的肿瘤细胞，表明CAR-T细胞在H3K27M突变型胶质瘤中有潜在的治疗效果[35]。除了CAR-T细胞，肿瘤疫苗也可能是一种有价值的治疗药物。Ochs等[36]设计了抗H3K27M突变的多肽疫苗，结果显示该疫苗可激活小鼠细胞免疫而发挥抗胶质瘤活性。然而，该研究结果是基于皮下肿瘤模型，该多肽疫苗在颅内抗肿瘤的效果还需要进一步明确。另一类可作为免疫治疗的理想靶点为肿瘤/睾丸抗原，它们通常只在睾丸组织中表达，但是往往在肿瘤中高表达。研究发现，H3K27M突变可以激活儿童胶质瘤细胞中多种肿瘤/睾丸抗原，如VCX3A(variable charge X-linked 3A)和白细胞介素-13受体α2等[24]。利用干扰小RNA敲降VCX3A能够特异性减少H3K27M突变型胶质瘤细胞增殖。由于抗白细胞介素13受体α2 CAR-T细胞治疗方案在成人胶质瘤中显示出良好的抗癌活性[37]，因此探究其抗儿童H3K27M突变型胶质瘤活性具有重要意义。

4 小 结

儿童H3K27M突变型胶质瘤病理机制与成人胶质瘤截然不同，这解释了基于成人临床数据的分子靶向治疗策略对儿童患者效果不佳的原因。由于携带H3K27M突变基因胶质瘤患者的预后更差，临床通常会利用免疫组织化学、荧光定量聚合酶链反应、Sanger测序等技术明确其基因型[38]。近年来，对H3K27M突变型胶质瘤发生发展的分子机制以及靶向治疗药物等研究取得了很大进展，但是尚需对以下几个方面进行更深入的研究：①H3K27M突变增加染色质局部特定区域H3K27me3修饰水平的机制；②H3K27M突变上调H3K27ac修饰以及引起DNA低甲基化的分子机制；③H3K27M突变型胶质瘤中通常伴随其他基因突变，它们是否与H3K27M突变存在相互交联及其交联的分子机制；④在实验室水平多种药物显示出对H3K27M突变型胶质瘤有靶向治疗效果，但是这些药物的生物利用度、血-脑屏障和血-肿瘤屏障穿透程度、药动学、肿瘤组织药物浓度等需要明确。因此，未来尚需进行更多研究以深入探索儿童H3K27M突变型胶质瘤的分子机制以及有效的靶向治疗策略。