环状RNA在眼科疾病发生发展中的作用机制研究进展△

李华健 李鹏飞 陈雨欣 王 勇

1976年，Sanger等[1]首次在病毒和类病毒中发现闭合环状结构的RNA分子，并将其命名为环状RNA(circRNA)。随后，有学者在电子显微镜下观察到真核细胞的细胞质中也存在circRNA[2]。由于传统的分子生物学实验方法对circRNA数量的检测能力非常有限，因此一直以来circRNA被认为是RNA异常剪接的产物。直到近些年由于二代测序技术的迅速发展，circRNA的重要地位才逐渐被凸显出来[3]。目前，人们通过高通量测序技术和生物信息学分析发现，人类独有的circRNA超过10万种，其中大部分circRNA不仅结构稳定且呈现出时空表达特异性，说明circRNA可能在调控基因表达过程中发挥重要作用[4]。

circRNA根据基因来源位置的不同可分为外显子组成的circRNA(ecircRNA)，外显子和内含子组成的circRNA (ElciRNA)，内含子组成的circRNA(ciRNA)和基因间circRNA(intergenic circRNA)[5]。关于circRNA的形成，目前主流的假说是“外显子跳读驱动环化”和“内含子配对驱动环化”。“外显子跳读驱动环化”指外显子跳读形成包含外显子和内含子的套索结构，套索结构中内含子被切除形成ecircRNA或不被切除直接形成ElciRNA；“内含子配对驱动环化”指含有反向重复序列的内含子配对使下游外显子的3’端反向与上游外显子5’端共价连接形成闭合环状结构，最终形成ecircRNA或ElciRNA。另外，内含子套索的脱分支失败会导致ciRNA的产生[4,6]。许多circRNA含有单个或多个微小RNA(miRNA)结合位点，可以作为竞争内源性RNA，通过“海绵吸附”机制逆转miRNA对其靶基因的降解作用，促进靶基因的表达[7]。此外，circRNA可与RNA结合蛋白结合形成RNA-蛋白质复合体，影响相关蛋白作用模式，在转录及转录后水平上调控基因表达[8]。近年来也有研究发现，部分circRNA具有内部核糖体进入位点序列，能够进入核糖体翻译多肽及蛋白质，从而发挥生物学功能[9]。

1 circRNA与角结膜病

1.1 角膜新生血管角膜新生血管是指角膜缘新生血管侵入角膜的现象，可导致患者视力下降和失明。角膜的免疫、创伤或感染性疾病都可促进与角膜新生血管形成相关的血管生成因子的产生[10]。Zhou等[11]对碱烧伤诱导的角膜新生血管小鼠的角膜组织进行circRNA微阵列芯片分析，共鉴定出229个差异表达的circRNA(174个上调，55个下调)，其中cZFP609和cKifap3的异常表达最明显。随后人们在6例化学烧伤及8例角膜炎患者的角膜样本中也发现cZFP609表达明显上调，而cKifap3表达明显下调。深入研究显示，下调cKifap3表达可使其竞争性结合miR-184的能力减弱，进而抑制靶分子蛋白激酶B(Akt)、血管内皮生长因子(VEGF)表达，抑制角膜新生血管形成。Wu等[12]研究发现，与正常大鼠相比角膜缝合术后大鼠角膜上皮中cZNF609表达显著升高。cZNF609通过吸附miR-184，提高Akt、VEGF和β-连环蛋白(β-catenin)等基因的表达，促进角膜新生血管形成。对cZNF609的干预可能是角膜新生血管治疗的潜在策略。

1.2 翼状胬肉翼状胬肉是一种常见的眼表疾病，以结膜下纤维组织增生和血管侵入角膜为特征[13]。异常细胞增殖、伤口愈合缺陷、细胞转化、异常基质重构、血管生成、氧化应激和遗传易感性都与翼状胬肉的形成和发展有关[14]。Liu等[13]研究发现，与正常结膜组织相比，翼状胬肉中有21个circRNA存在差异表达(11个上调，10个下调)。经PCR验证，hsa_circ_0007482、hsa_circ_0023988和hsa_circ_0004846在翼状胬肉组织中表达上调，hsa_circ_0000151和hsa_circ_0012935在翼状胬肉组织中表达下调。GO(gene ontology)分析显示，上调的circRNA主要与上皮管样形成和凋亡有关，而下调的circRNA主要参与上皮细胞发育、血管生成和间充质细胞增殖。KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析显示，异常表达的circRNA富集于黏蛋白型O-聚糖生物合成途径。circRNA的异常表达可能与翼状胬肉的形成有关。

2 circRNA与青光眼

原发性开角型青光眼是一种神经退行性疾病，以视网膜神经节细胞丢失和视野缺损，同时伴随病理性高眼压为特征[15]。此外，Müller细胞作为视网膜中一种特殊的放射状胶质细胞，对视网膜神经元起到支持和滋养的作用，与原发性开角型青光眼的发病有关。Wang等[16]对经过微球注射诱导的大鼠慢性高眼压模型研究发现，cZRANB1表达显著增加。cZRANB1通过吸附miR-217提高RUNX2基因的表达，促进视网膜反应性胶质增生和Müller细胞活化，加速视网膜神经节细胞变性，造成视网膜功能损害和视力下降。另一项研究发现，cZNF609在巩膜上静脉结扎诱导的大鼠慢性高眼压模型中的表达显著上调[17]，沉默cZNF609能够抑制视网膜反应性胶质增生和Müller细胞活化，延长视网膜神经节细胞存活时间，进而延缓原发性开角型青光眼发病进程。上述发现为视网膜神经退行性病变的发病机制研究提供了新的方向。但这些研究都只是在动物模型中进行，是否在青光眼患者视网膜中存在同样的调控网络目前尚不明确。

3 circRNA与白内障

白内障是世界首位致盲性眼病，其中年龄相关性白内障(ARC)是最为常见的白内障类型。其发病机制尚不明确，晶状体上皮细胞(LECs)的氧化损伤是白内障发生的关键因素。持续的氧化刺激会引发自由基特别是含氧自由基异常增高，进而导致LECs细胞核DNA的氧化损伤、氧化应激，引发LECs损害和凋亡，这是ARC发病的分子病理基础。Cui等[18]研究了25例ARC患者和20例透明晶状体上皮组织发现，circHIPK3在ARC患者晶状体中表达下调。过表达circHIPK3促进了人LECs(SRA01/04)的增殖。circHIPK3通过充当miR-221-3p的“分子海绵”，增强p-PI3K和p-AKT基因的表达，激活下游PI3K/Akt信号通路(磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路)保护人LECs免受氧化损伤和凋亡。Du等[19]在3例ARC患者和3例健康者外周血中共发现242个差异表达的circRNA(100个上调，142个下调)，并预测了这些circRNA可能的miRNA结合位点。GO分析显示，异常表达的circRNA与细胞代谢过程、发育及RNA转录有关。KEGG通路分析显示，异常表达的circRNA富集于丝裂原活化蛋白激酶、肿瘤坏死因子以及PI3K/Akt信号通路。Liu等[20]在年龄相关性皮质性白内障(ARCC)患者LECs和紫外线照射的SRA01/04细胞中发现circMRE11A表达上调，敲低circMRE11A可以提高LECs活力。共济失调毛细血管扩张突变基因(ATM)活化参与DNA的氧化损伤应答，然而ATM的过度活化(ATM-S1891p)，可引起下游p53、p21基因激活从而诱导细胞周期阻滞。circMRE11A与UBX结构包含蛋白1(UBXN1)相互作用，诱导ATM过度激活，通过ATM/p53/p21途径诱导LECs的细胞周期阻滞，参与ARCC的形成。Li等[21]对3例ARCC患者和3例对照受试者LECs中6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰的circRNA进行了全基因组分析。m6A是最为常见的一类RNA修饰，广泛存在于酵母、植物、果蝇、以及哺乳动物等各类真核生物中。该研究发现，ARCC患者LECs中有4233个circRNA表达上调和4561个circRNA表达下调。并且总共有2700个m6A峰在circRNA中显著差异表达(1469个上调，1231个下调)。ARCC患者LECs中circRNA的m6A修饰与circRNA的表达水平呈负相关。他们的研究为circRNA及其m6A修饰参与ARC发生发展提供了新的证据。

研究表明，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者的白内障发病年龄更早，进展更快，发病率也更高。这可能与高血糖诱导的LECs增殖、凋亡和自噬有关[22]。Fan等[23]对6例糖尿病性白内障患者前囊膜组织和3例透明前囊膜组织进行circRNA表达谱分析，共发现1063个差异表达的circRNA，其中135个circRNA表达上调两倍以上，928个circRNA表达下调两倍以上。circKMT2E可以作为“分子海绵”吸附miR-204-5p，但是circKMT2E与miR-204-5p之间的结合位点只是生物信息学上的预测，并没有经过实验证实。

晶状体后囊膜混浊(PCO)是白内障术后常见的远期并发症。有研究表明，上皮-间充质转化是PCO的主要发病机制，即上皮细胞转化为成纤维细胞，向后囊迁移，细胞外基质蛋白分泌过多，导致PCO形成。Liu等[24]研究发现，circ-CARD6在PCO组织中高表达，敲低circ-CARD6抑制了LECs的增殖、转移和上皮-间充质转化过程。成纤维细胞生长因子7可以促进LECs增殖和新生血管生成，circ-CARD6通过吸附miR-31促进成纤维细胞生长因子7基因的表达，加速PCO形成。因此circ-CARD6有可能成为PCO的防治靶点。

4 circRNA与视网膜病变

4.1 糖尿病性视网膜病变糖尿病性视网膜病变是糖尿病严重的微血管并发症[25]。其特征是视网膜毛细血管渗漏、炎症和新生血管生成，发病机制较复杂。Shan等[26]研究发现，链脲佐菌素诱导的糖尿病性视网膜病变小鼠模型和高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞中circHIPK3表达均显著上调，沉默circHIPK3可降低人视网膜血管内皮细胞的增殖和迁移能力，使视网膜毛细血管渗漏和炎症得到改善。Zhu等[27]研究发现，高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞中circDNMT3B表达下调，过表达circDNMT3B可降低无细胞型毛细血管的生成，减少高糖对视网膜血管功能的损伤。转化生长因子-β受体拮抗剂BAMBI可以抑制人视网膜微血管内皮细胞的增殖、迁移和管样形成。circDNMT3B通过吸附miR-20b-5p增强BAMBI基因表达，延缓糖尿病性视网膜病变进展。但上述实验都是用高糖刺激人视网膜微血管内皮细胞短时间形成的细胞模型，考虑到糖尿病性视网膜病变的进展涉及长期的高血糖和慢性炎症，这类细胞模型可能不是糖尿病性视网膜病变机制研究的最佳选择。

4.2 增生性玻璃体视网膜病变增生性玻璃体视网膜病变是视网膜脱离手术失败的主要原因，是由于增殖膜的收缩从而牵拉视网膜导致其脱离所致，可能与视网膜前膜的形成有关。Yao等[28]对30例增生性玻璃体视网膜病变患者的视网膜前膜和30例白内障患者的继发性视网膜前膜进行circRNA微阵列芯片分析，发现91个差异表达的circRNA(55个上调，36个下调)。circ_0043144在增生性玻璃体视网膜病变患者的玻璃体液和血清中均显著上调。沉默circ_0043144显著降低趋化因子CCL2、CXCL8和白细胞介素-8等基因的表达，抑制人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)的增殖和迁移能力。但该研究并未对circ_0043144可能结合的miRNA或蛋白等中间调控介质展开深入研究。

4.3 早产儿视网膜病变早产儿视网膜病变是一种视网膜血管增生性疾病。其病理过程包括两个阶段:第一阶段为早产后高氧诱导的视网膜血管不完全生长，即血管闭塞期；第二阶段为缺氧驱动的病理性血管增生，即新生血管期。Liu等[29]在氧诱导视网膜病变的小鼠模型中发现，cZNF609的表达在血管闭塞期显著下调，而在新生血管期上调。沉默cZNF609可减少病理性视网膜血管生成，减轻视网膜炎症反应。肌细胞增强因子2A活化与血管内皮细胞功能密切相关。cZNF609通过充当miR-615-5p的“分子海绵”，增强肌细胞增强因子2A表达，促进人视网膜血管内皮细胞迁移、管样形成和凋亡。早产儿视网膜病变的发生发展可能与cZNF609有关。

5 circRNA与年龄相关性黄斑变性

年龄相关性黄斑变性(AMD)可分为干性和湿性两种亚型。干性AMD以视网膜色素上皮、脉络膜毛细血管和光感受器萎缩为特征。蓝光、吸烟、氧化应激、脂褐素积聚和慢性炎症等均与干性AMD的发生发展有关。Chen等[30]对9例AMD患者和6例健康对照者的血清进行circRNA微阵列芯片分析发现，AMD患者血清中circNR3C1表达下调。敲低circNR3C1导致ARPE-19细胞的吞噬能力被抑制。研究发现，磷酸酯酶和张力蛋白同系物PTEN的失活与视网膜变性有关[31]。circNR3C1通过吸附miR-382-5p，增加磷酸酯酶和PTEN基因的表达，抑制Akt/mTOR信号通路(蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路)，缓解干性AMD进展。

湿性AMD的特征是脉络膜新生血管的形成，表现为视网膜下水肿、渗出和出血，可致视力减退和视物变形[32]。Liu等[33]利用circRNA微阵列芯片分析了3只脉络膜新生血管小鼠和3只对照组小鼠视网膜色素上皮中circRNA的表达谱，共鉴定出100个异常表达的circRNA(59个上调，41个下调)。其中mmu_circRNA_20332和mmu_circRNA_19555上调和下调幅度最大。GO分析显示异常表达的circRNA可能与免疫应答和神经递质传递有关。上述研究表明，circRNA可能通过各种分子生物途径参与AMD的发生发展，但尚未发现确切的调控机制。

6 circRNA与眼部肿瘤

视网膜母细胞瘤(RB)是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，主要是由于视网膜发育过程中RB1基因的双等位基因缺失所引发，发病机制较复杂[34]。Zhang等[35]研究了45例RB及其邻近组织，发现circ_0000527在RB组织中高表达。circ_0000527通过竞争内源性RNA机制吸附miR-646，提高低密度脂蛋白受体相关蛋白6基因表达，加速RB细胞增殖、迁移和侵袭。circ_0000527可能与RB的发生发展有关。

葡萄膜黑色素瘤(UM)是成人最常见的原发性眼内恶性肿瘤。易发生早期转移，目前尚无有效的治疗方法，死亡率高。Yang等[36]利用circRNA微阵列芯片对5例UM和5例正常葡萄膜组织进行分析发现，UM中有50 579个异常表达的circRNA(20 654 个上调，29 925个下调)。GO分析显示，异常表达的circRNA主要与腺嘌呤核苷酸结合有关。KEGG通路分析则显示circRNA富集于PI3K/Akt信号通路以及Wnt信号通路。这项研究首次探索了UM中circRNA的异常表达，为UM的治疗提供了新的潜在靶点。

7 总结和展望

近年来，人们已经发现一些circRNA在眼科疾病的发生发展中发挥重要的作用。但目前对circRNA的研究主要集中在其病理生理过程中的表达变化，大多局限于离体细胞水平，需配合有效、可靠的动物模型作深入研究。如何将circRNA具体到临床实践应用，切实提高诊断准确性、治疗有效性还需长时间探索。对于circRNA生物学功能以及对下游靶基因的调控机制的探索在未来很长一段时间都会是眼科领域的研究热点。相信随着高通量测序技术和分子生物学的迅速发展，人们会发现更多与眼病相关的circRNA，为各类眼病的诊疗提供新的依据和方向。