昼夜节律与缺氧诱导因子途径对缺氧性心肌损伤影响的研究进展

邓 捷，贺建东，韩冲芳

昼夜节律是大约24 h的生物节律，可以使机体为昼夜周期带来的波动做好准备，使体内生物学功能与环境变化保持一致。在哺乳动物中，昼夜节律受生物钟的调节。生物钟可以分为位于下丘脑视交叉上核中的中央时钟[1]以及几乎存在于每个组织中的外围时钟[2]。光作为主要生物钟输入信号，通过视网膜转化为神经脉冲传输至视交叉上核的中央时钟，中央时钟将神经和体液信号传递到身体其他组织的外周时钟，使细胞时钟同步[3]。外周时钟除了接受中央时钟发出的信号，还响应其他组织特定的同步信号(例如食物摄入和锻炼)[4-6]。生物钟是心血管生理与疾病的重要调节器，心肌细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞中都存在外周时钟[7-10]，调节各种病理及生理功能，例如内皮功能、血压、心率及急性心肌梗死、心律失常的发生[11]。

1 生物钟的分子机制

生物钟由复杂的自动调控性转录-翻译反馈环组成，它们通过相互作用使生物钟控制的基因节律性表达，最终导致蛋白质组和细胞功能的振荡[12]。主反馈回路由核心生物钟基因组成，包括：芳烃受体核转运蛋白样蛋白(BMAL)1，生物钟运动输出周期蛋白kaput(CLOCK)，花隐色素(CRY)1、CRY2，周期生理蛋白(PER)1、PER2、PER3[13]。次要反馈回路由孤儿核受体(ROR)1、ROR2、视黄酸受体相关的孤儿受体Rev-erbα(也称为NR1D1)组成[14]。在24 h昼夜节律开始时，BMAL1和CLOCK蛋白形成复合物(异二聚体)。BMAL1-CLOCK异二聚体与PER和CRY时钟基因的增强子元件(E-box)结合，激活其转录和翻译(正反馈)。PER和CRY在细胞质中聚积，然后也形成异二聚体并转运至细胞核，从而抑制BMAL1-CLOCK的转录活性，并因此抑制其编码基因的转录(负反馈)。生物钟的核心元素(例如BMAL1和CLOCK)不仅可以保持时钟转动，而且还可以与时钟控制基因的E-box结合，从而实现大部分基因组24 h有节奏地激活。BMAL1-CLOCK异二聚体还激活ROR和Rev-erbα，这些组件竞争性结合位于BMAL1启动子区域的ROR反应元件(RORE)，从而导致BMAL1转录的激活或抑制。ROR1和ROR2充当BMAL的转录激活因子，而Rev-erbα抑制BMAL1转录[15]。对于BMAL1的节律性表达这个次级反馈回路是必不可少的。昼夜节律还受其他各种过程的调节，并且与这些反馈回路相辅相成。

2 缺氧诱导因子(HIF)途径传感细胞氧信号

HIF-1是哺乳动物细胞中氧稳态的中心调节因子。HIF-1是一种异二聚体转录因子并且在缺氧(低氧)条件下被激活。在含氧量正常的条件下，HIF-1α中氧依赖性降解结构域(ODD)的脯氨酸残基处被脯氨酰羟化酶(PHD)羟基化，然后与E3泛素连接酶(von hippel-lindaum，VHL)结合，泛素化后被蛋白酶体降解。缺氧会抑制PHD的功能，从而导致HIF-1α稳定。在缺氧状态下，稳定的HIF-1进入细胞核，并与其靶基因启动子或增强子区域的缺氧反应元件(HRE)结合，这对细胞适应缺氧至关重要。这些靶基因中含有许多表达代谢酶的基因，这些基因对于调节低氧条件下的代谢平衡非常重要，而且低氧条件下代谢途径产生的特定代谢物和活性氧(ROS)会抑制PHD[16]。HIF-1在与缺氧有关的心血管疾病中也起着作用[17-18]。

3 HIF和昼夜节律之间的双向作用

昼夜节律与HIF途径相互联系的一种方式是，它们都涉及含PAS结构域的蛋白质[19]。HIF-1α、HIF-1β、BMAL1和CLOCK都是碱性螺旋-环-螺旋蛋白(bHLH)-PAS转录因子超家族的一部分[20]，bHLH-PAS转录因子感知并响应生理和环境信号。HIF-1不仅可以与BMAL1结合调节昼夜节律基因表达，还会随着BMAL1/CLOCK改变而产生昼夜节律震荡，除此之生物钟和HIF途径还可以通过间接机制相互作用，生物钟通过控制代谢通量对HIF-1α进行昼夜节律控制。

3.1 HIF与E-box和BMAL1结合调节昼夜节律基因表达 研究发现，HIF-1α和HIF-2α与昼夜节律因子BMAL1之间有直接物理相互作用的潜力，从而影响动物模型及人类中昼夜节律基因的表达。在电泳迁移率变动分析中HIF-1α和BMAL1能够直接彼此结合，可以在特定条件下形成异二聚体发生共免疫沉淀，并结合了E-box DNA元件，共表达激活了E-box驱动的荧光素酶报道基因。在骨骼肌细胞和人骨肉瘤细胞(U2OS)中，用HIF-α活化药物二甲基乙二酰基甘氨酸(DMOG)处理后可延长生物钟基因的昼夜节律周期，并降低PER2和BMAL1的振幅，提示HIF-1α与E-box结合会导致昼夜节律紊乱[21-22]。在斑马鱼中，低氧暴露降低了PER2基因的昼夜节律振幅，而CLOCK的遗传破坏降低了对急性低氧反应的HIF-1α活化和活性[23]。氧水平不仅会影响分子时钟功能，而且会影响动物的整个行为学[24-25]。

3.2 HIF-1α基因中含有启动子E-box HIF-1α基因在其启动子区域包含一个E-box序列，并且在U20S细胞中使用结合位点分析法(ChIP-seq)观察到BMAL1/CLOCK与HIF-1α启动子区域的直接结合。在小鼠肝脏、心脏和肾脏中，HIF-1α mRNA转录物具有昼夜节律振荡[25-26]。在小鼠骨骼肌细胞中，BMAL1的低表达也会降低HIF-1α活性和糖酵解。BMAL1/CLOCK通常会与诸如PER和CRY等生物钟基因中的E-box结合，并且鉴于HIF-1α基因包含一个E-box，在小鼠中BMAL1/CLOCK在白天趋于高峰时，HIF-1α的表达在BMAL1/CLOCK活性最大时期达到峰值[21]。小鼠在活动期间(对应于人类的白天)进行运动时，低氧对HIF-1α靶基因有更大的诱导作用，这表明昼夜节律控制着对骨骼肌运动的HIF依赖性转录反应[21]。

3.3 生物钟基因CRY1和PER2与HIF-1α相互作用以改变低氧反应 CRY1能够维持昼夜节律周期长度和振幅，并直接与HIF-1α相互作用从而改变了低氧反应[18，24]。低氧小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)进行的免疫共沉淀分析发现，CRY1的尾部区域可以与HIF-1α的bHLH域结合。HIF-1α的bHLH结构域需要与靶基因的启动子结合才可启动其转录，而CRY1与HIF-1结合后抑制HIF-1转录激活作用，并缩短了HIF-1α的半衰期[24]。相反，在缺氧的Hela细胞中，PER2可以直接与HIF-1α结合，并且充当效应蛋白将HIF-1募集到HRE区域。PER2可增强HIF-1活性，而不会在mRNA或蛋白质水平上影响HIF-1α的表达[27]。PER2对于缺氧状态下的HIF-1α稳定是必需的，众所周知HIF-1α在低氧代谢适应中的作用，并在随后的研究确定PER2是碳水化合物代谢的调节剂并且在心肌损伤期间具有心脏保护作用，因此两者在心肌缺血再灌注可能通过代谢调节共同发挥作用。

3.4 昼夜节律和HIF-1α的连接点：Sirtuins 低氧和昼夜节律之间的双向关系的另一个层面包括与Sirtuins的连接，Sirtuins及其辅助因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)+在昼夜节律的控制下，因此代谢调节途径可能处于生物钟-HIF-1α连接的十字路口。核沉默蛋白(SIRT)1、SIRT6、SIRT7负责有节奏的组蛋白乙酰化，表示生物钟基因对Sirtuins的昼夜节律有控制作用[28-29]。SIRT1可以直接使HIF-1α脱乙酰化，从而使HIF-1α失活[30]。缺氧下，HIF-1α的乙酰化和活性加剧，这在很大程度上是由于NAD+减少后SIRT1受到抑制。在常氧条件下，SIRT6可以抑制糖酵解基因的表达，表明其作为组蛋白脱乙酰基酶的功能来抑制HIF-1α[31]，SIRT6可能通过减弱HIF-1α转录输出而促进线粒体的氧化代谢[32]。线粒体SIRT3是癌细胞中Warburg效应(在存在大量可用氧的情况下进行糖酵解)的关键调节剂，它通过使HIF-1α不稳定来实现。在没有SIRT3的情况下，ROS会因此增加，随之HIF-1α的稳定性就会增加。研究表明SIRT3在缺血和再灌注损伤模型中具有心脏保护作用，并且SIRT3保护心肌细胞免受氧化应激的影响[33-35]。

4 心血管疾病中的昼夜节律紊乱与缺氧

低氧在心血管疾病的病理生理中起着至关重要的作用，这些缺氧性疾病的发生和后遗症经常表现出昼夜节律变化[36]，这表明低氧和昼夜节律途径之间的相互作用可能对人类健康产生重要影响。HIF通过包括代谢适应，血管生成和干细胞生态在内的关键途径在缺氧或局部缺血中的心脏保护作用已被充分证实。例如，PHD基因缺失可能够稳定HIF-1α，可通过包括血管内皮生长因子(VEGF)促血管生成信号通路和内皮一氧化氮合酶通路等途径增加血管生成和恢复心肌梗死后心功能[37-38]。七氟烷预处理后通过蛋白激酶B(Akt)信号激活HIF-1α，再激活下游血管内皮生长因子增加血管生成可以有效改善病变区域的缺氧情况，抑制缺血/再灌注损伤[39]。为了增加灌注，HIF-1激活诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和增加细胞色素氧化酶亚基4-2(COX4-2)表达，从而增加一氧化氮的产生，导致血管舒张，增加细胞的血液和氧气供应[40-41]。此外，心脏外植体的细胞或内皮细胞中通过低氧或PHD抑制剂稳定HIF-1α的相关实验揭示了HIF-1α在成体干细胞中的潜在作用，包括调节心脏干细胞参与增殖的标记基因与涉及多能干细胞端粒酶(TERT)基因表达[42-43]。还观察到HIF-2α和Oct4在胚胎样间充质干细胞(vselMSCs)中协同上调它们的靶基因，包括促血管生成因子促血管生成素-1(Ang-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子以及抗凋亡蛋白(Bcl2)、促凋亡蛋白(Caspase-3)，从而诱导血管生成、分化和抗凋亡，HIF-2α促进了人极细小胚胎样间充质干细胞(vselMSCs)在心肌梗死中的存活和心肌修复[44]。

重要的是，缺氧的干细胞必须调节细胞代谢，以维持适当的细胞干性或增殖能力和分化能力，而这些都与HIF密切相关[45]。在常氧状态下，三羧酸循环将NAD+和FAD 还原为还原型辅酶Ⅰ(NADH)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH)2，后者通过氧化磷酸化而被氧化。然而，在缺氧期间，线粒体呼吸链阻止了NADH和FADH2被氧化。因此，当氧气的可用性受到限制时，HIF-1介导的代谢适应使代谢物脱离线粒体以调节TCA循环通量和氧化磷酸化；通过丙酮酸脱氢酶磷酸化抑制乙酰辅酶a进入三羧酸循环；通过诱导Bnip3(促进线粒体自噬)和Mxi1(线粒体生物发生的负调节剂)增强线粒体自噬降低呼吸能力，从而总体上降低ROS的产生[46]。组织缺氧会触发HIF-1α/HIF-1稳定，BNIP3L依赖的线粒体也调节促炎性M1巨噬细胞的极化，其在炎症反应过程中经历糖酵解依赖性分化[47]。揭示了缺氧状态下，线粒体吞噬和代谢重编程之间的新联系。HIF-2α通过上调其靶基因双调蛋白(AREG)、心肌中表皮生长因子受体1(ERBB1)和激活磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号通路在增加缺血耐受性[48]。对HIF在心脏缺血事件或干细胞在低氧环境的代谢适应的了解，可能有助于进一步说明HIF-1α和HIF-2α在缺血再灌注损伤中发挥的作用。

最近的研究表明，心肌细胞内在的昼夜节律可能与心血管生理的时间依赖性有关。在人类中心肌梗死的发作也表现出明显的昼夜节律，与夜晚相比，清晨的发病率增加[36，49-51]。围术期心肌损伤的病人中，昼夜节律基因表达在转录水平发生改变[52]。Reiter等[53]报道在ST段抬高型心肌梗死后心肌梗死面积大小和左心室功能具有昼夜节律的依赖性。有很多证据支持 BMAL1基因敲除和Clock-mutant小鼠具有内皮功能障碍。BMAL1基因在内皮细胞中的遗传消融会增强Ccl8、Ccl20和Cxcl5损害内皮完整性和屏障功能[54]。此外，Gao等[55]研究认为，生物钟可能驱动内皮细胞表达细胞间黏附分子-1并促进单核细胞黏附到内皮细胞。小鼠中的PER2基因导致主动脉内皮细胞相关功能障碍，可能与一氧化氮和前列环素产生减少和环氧化酶-1增加有关[56]。一般而言，昼夜节律对于维持正常的内皮细胞功能很重要。

BMAL1以时间依赖性方式调节PI3K，在心脏外组织中胰岛素敏感性处于昼夜节律控制下所以胰岛素信号级联反应中PI3K的下游成分，即AKT和GSK3β，受心肌细胞昼夜节律的调节[57]。除此之外，有研究表明敲除BMAL1基因后H2S通过PI3K / Akt信号通路抑制线粒体凋亡的功效受损，心肌保护作用减弱[58]。Clock△19/+小鼠中蛋白酶体和自噬对BMAL1降解的双重衰减有助于改善葡萄糖稳态，说明BMAL1在心肌细胞的糖代谢中发挥重要作用[59]。这些研究共同强调了BMAL1基因在保护心肌中的新功能。缺血和I/R损伤后心肌中NAD+的含量均降低，多种NAD+前体包括NA，NAM，NMN和NAD+本身可以恢复NAD+水平，减少心肌梗死(MI)大小并防止体内I/R损伤[60]。NAD+补充可以通过多种机制发挥心肌保护作用包括减少氧化应激，防止自噬过度激活，线粒体功能的恢复以及RISK的激活。先前的研究表明，Nampt 基因表达受CLOCK和BMAL1以及SIRT1的调节，从而导致有节律性维持细胞NAD+水平[61]。细胞中缺乏BMAL1导致SIRT3活性降低和线粒体蛋白乙酰化增强，从而导致氧化酶功能降低。最后，用NMN补充NAD+可以恢复昼夜节律突变小鼠的SIRT3靶蛋白脱乙酰并增强线粒体功能。生物钟节律性调节NAD+生物合成，使线粒体的氧化能力发生振荡。使用NAD+作为昼夜节律和代谢周期耦合的中心环节可提供一种快速且可逆的机制，使细胞改变线粒体的氧化功能以适应明暗周期变化[62]。

HIF-1α预处理心脏，使其具有更有效的氧代谢特性，并为缺氧的心肌提供心脏保护作用。HIF和昼夜节律网络之间的相互作用有助于这种反应。强光诱导使HIF-1α-HRE结合增强，以增加外周血PER2介导的心脏保护作用[63]。此外Per2还可以通过ADORA2B依赖性途径稳定HIF-1α，这对心肌适应缺氧反应至关重要[26]。Wu等证明了时钟网络通过调节具有心脏保护作用的HIF-1的靶基因和心肌损伤(如BNIP3引起的凋亡)之间的平衡来应对心肌梗死的低氧反应。最终作者得出结论，昼夜节律性时钟有助于保护心脏免受缺氧引起的细胞死亡[22]。

5 结 语

尽管最近的工作揭示了脊椎动物动物模型以及人类中昼夜节律与氧气感应通路之间的新颖联系，但仍然存在一些核心问题。首先，CLOCK-HIF 通路是如何在机械水平上相互作用的？时钟和HIF因子是否直接bHLH-PAS域异二聚化，或者是否存在间接途径，仍然是未知的。需要基因组学研究来确定生物钟转录因子和HIF因子在染色质上转录调控位点的相互作用，以充分确定两者是否直接异源二聚化，以及它们是否在体内形成转录复合物。另外有必要分析和了解缺氧应激条件下生物钟驱动的代谢通量的全部范围，以确定生物钟是否调控其他的HIF调节代谢产物(例如琥珀酸酯、富马酸酯、α-酮戊二酸酯、2-羟基-α- 酮戊二酸、ROS)。

最后，还有其他机制可以将生物钟与低氧反应联系起来吗？在哺乳动物细胞中，还有许多其他的氧敏感蛋白，包括含有Jumonji结构域的组蛋白赖氨酸和精氨酸脱甲基酶家族，它们表现出与缺氧诱导因子PHD1-3和低氧诱导因子-1抑制因子(FIH)相似的α-酮戊二酸依赖性加氧酶活性。多项研究表明，该家族成员(例如JMJD5)与植物、果蝇和哺乳动物细胞的中央时钟功能之间存在联系，并且表明小鼠肝脏中存在约24 h的组蛋白甲基化节律[64]。然而，氧依赖性脱甲基酶决定昼夜节律的程度以及缺氧是否可以通过蛋白质脱甲基化来重新编程昼夜节律转录仍未得到很好的研究。

随着发现生物钟与代谢调节剂之间的新联系，不仅要考虑生物钟对日常基础代谢稳态的控制，而且还要考虑生物钟如何预测昼夜节律中不同时期的环境压力。在这个概念上，保守进化的CLOCK与HIF通路的相互作用就是一个有趣且据有潜在治疗意义的解释。总体而言，对昼夜节律与低氧通路之间联系的研究将为深入了解缺氧性心肌损伤提供新见解。