甲状腺乳头状癌患者血清miR-34a-5p、miR-4709-3p水平变化及其诊断效能

刘颖，查卫娜，杨晓琳，姜泰先，刘阁玲，王茜

1苏州大学附属第一医院感染科，江苏苏州 215000；2唐山市工人医院内分泌一科；3华北理工大学附属工人医院内分泌一科

甲状腺癌是最常见的内分泌系统肿瘤［1］，其中以甲状腺乳头状癌（PTC）最为常见，占85%～90%［2］。PTC经治疗预后良好，但局部复发率为2%～6%，远处转移率为1%～2%［3］，仍有0.5%的患者可能死于甲状腺微小乳头状癌［4］。早期诊断有助于改善PTC患者的预后［5］。甲状腺细针穿刺细胞学检查为最常用的PTC术前确诊手段［6-7］，然而对于15%～30%的患者，甲状腺细针穿刺检查无法进行细胞形态学鉴别［8］。近年来，分子标志物在甲状腺结节临床诊断方面逐渐显示出优势［9-11］。多项研究表明，miRNA可作为PTC诊断的分子标志物［12-15］。本课题组前期研究通过TCGA（癌症基因组图谱）数据库筛选出PTC组织中表达差异性最显著的2个miR即hsa-miR-4709-3和hsa-miR-34a-5p，并验证了PTC组织中hsa-miR-4709-3、hsa-miR-34a-5p表达高于癌旁组织。本研究进一步观察了PTC患者血清miR-4709-3p、miR-34a-5p水平变化，并分析两项指标对PTC的诊断效能。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象与分组选取2020年1月—10月于唐山市工人医院就诊并接受手术治疗的甲状腺结节患者纳入研究。根据手术病理检查结果分为PTC组和良性结节组，各50例。收集两组患者血清备检。本研究已获得患者知情同意，获唐山市工人医院伦理委员会审批通过。PTC组、良性结节组年龄分别为（43.22±12.23）、（46.40±14.30）岁，BMI分别为（24.27±3.19）、（25.20±2.75）kg/m2。PTC组、良性结节组结节最大径差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 PTC组与良性结节组一般临床资料比较（例）

1.2 血清miR-34a-5p、miR-4709-3p检测采用实时荧光定量PCR法。miR-4709-3p引物序列为5＇-TTGAAGAGGAGGTGCTCTGTAGC-3＇，miR-34a-5p引物序列为5＇-GGTGTGGGCTGGCAGTGTCTT-3＇，内参U6引物序列为5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇。引物由上海生工生物工程股份有限公司提供。采用miR提取试剂盒提取样本总miR，使用反转录试剂盒反转录获得cDNA，采用miRcute miR Detection Kit（SYBR Green）试剂盒（含miR通用引物）检测血清中的miR-4709-3p、miR-34a-5p。PCR反应条件：94℃2 min，94℃20 s、60℃30 s，共40个循环。以2-ΔΔCt表示miR-4709-3p、miR-34a-5p相对表达量。

1.3 统计学方法采用SPSS19.0统计软件。收集两组性别、年龄、吸烟史、饮酒史、糖尿病史、高血压病史、身高、体质量指数（BMI）、甲状腺结节最大径等资料；收集PTC组患者病理类型、淋巴结转移状况和TNM分期等资料。正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料以M（IQR）表示，组间比较比较采用Wilcoxon秩和检验。计数资料比较采用χ2检验。多因素分析采用Logistic回归模型。采用受试者工作特征（ROC）曲线进行诊断效能检验：以术后病理结果为“金标准”，用Medcalc软件绘制ROC曲线并计算曲线下面积（AUC），根据ROC曲线上的标准值和坐标筛选两种miR判断结节良恶性的截断值，计算敏感度、特异度以评价诊断的真实性，计算Kappa值评价诊断结果与“金标准”的一致性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-34a-5p、miR-4709-3p水平比较PTC组、良性结节组血清miR-4709-3p水平分别为9.106（8.96）、1.498（1.40），miR-34a-5p水平分别为3.622（2.55）、1.226（0.64），PTC组血清miR-34a-5p、miR-4709-3p水平均高于良性结节组（P均＜0.05）。

2.2 血清miR-34a-5p、miR-4709-3p与PTC发病的关系以甲状腺结节患者病理检查结果良恶性为因变量，血清miR-4709-3p、miR-34a-5p水平及甲状腺结节最大径为自变量，进行多因素Logistic回归分析，结果显示，血清miR-4709-3p（OR=2.106，95%CI1.406～3.157）、miR-34a-5p（OR=4.700，95%CI2.008～10.998）水平是PTC的影响因素。见表2。

表2 PTC影响因素的Logstic回归分析结果

2.3 血清miR-34a-5p、miR-4709-3p对PTC的诊断效能血清miR-34a-5p诊断PTC的AUC为0.910（95%CI0.837～0.958），考虑PTC是恶性疾病，应提高敏感度，减少漏诊，故取1.765为截断值进行诊断试验评价；与病理检查结果相比，血清miR-34a-5p诊断PTC的灵敏度为92.0%、特异度为86.0%、约登指数为0.78、Kappa值为0.78，血清miR-34a-5p检测的诊断结果与病理检查结果一致性较高。血清miR-4709-3p诊断PTC的AUC为0.924（95%CI0.853～0.976），选择敏感度提高至90.0%时的截断值2.395进行诊断试验评价；血清miR-4709-3p诊断PTC的灵敏度为90.0%、特异度为80.0%、约登指数为0.70，Kappa值为0.70，血清miR-4709-3p检测的诊断结果与病理检查结果一致性一般。见图1、表3、表4。

图1 血清miR-34a-5p、miR-4709-3p诊断PTC的ROC曲线

表3 血清miR-34a-5p检测对PTC的诊断效能（例）

表4 血清miR-4709-3p检测对PTC的诊断效能（例）

3 讨论

循环miR作为非侵入性分子标志物，在甲状腺癌的诊断中有重要研究价值［16-19］。有学者对甲状腺癌外泌体miR谱进行分析，认为外泌体miR-5189-3p对PTC的诊断效能最佳［20］。LIANG等［21］分析了血浆miRs对PTC的诊 断效 能，认 为miR-16-2-3p、miR-223-5p等是区分PTC和甲状腺良性结节的最有力的生物标志物。在甲状腺癌循环miRs相关研究中，针对血清miR-34a-5p鉴别PTC和良性结节的研究较为少见。本课题组前期研究筛选出hsa-miR-4709-3和hsa-miR-34a-5p在PTC组织中表达差异显著，验证了PTC组织中hsa-miR-4709-3、hsa-miR-34a-5p表达高于癌旁组织。本研究在此基础上，进一步观察了PTC患者血清miR-4709-3p、miR-34a-5p水平变化，结果显示，PTC患者血清miR-34a-5p、miR-4709-3p水平高于良性结节组，提示miR-34a-5p、miR-4709-3p可能与PTC的发病有关，有望成为PTC的诊断标志物。

本研究中，PTC组和良性结节组的结节最大径差异有统计学意义，而高血压病史、糖尿病病史、吸烟史、饮酒史、结节家族史、性别、年龄、BMI等临床变量差异无统计学意义，避免了研究结果因一般临床信息分布不均匀而产生误差。进一步以甲状腺结节患者病理检查结果良恶性为因变量，以血清miR-4709-3p、miR-34a-5p水平及结节最大径为自变量，进行多因素Logstic分析，结果显示，血清miR-4709-3p、miR-34a-5p是PTC的影响因素，可能有助于鉴别PTC与良性甲状腺结节。

结合PTC的疾病特点，综合考虑PTC的疾病自然病程与手术收益，在选择早期诊断方法时，应尽量减少漏诊，诊断方法应有比较高的敏感度。根据本研究中血清miR-34a-5p、miR-4709-3p诊断PTC的ROC曲线，选择敏感度较高时的截断值（分别为1.765、2.395）进行诊断试验评价。以血清miR-34a-5p水平＞1.765作为诊断PTC的依据时，其诊断结果与术后病理诊断结果相比，灵敏度为92.0%、特异度为86.0%、约登指数为0.78、Kappa值为0.78，说明血清miR-34a-5p检测对PTC的诊断效能较好，与病理检查结果一致性较高。以血清miR-4709-3p水平＞2.395作为诊断PTC的依据时，其诊断结果与术后病理诊断结果相比，灵敏度为90.0%、特异度为80.0%、约登指数为0.70，Kappa值为0.70，血清miR-4709-3p检测对PTC有一定诊断效能，但诊断结果与病理诊断结果一致性较miR-34a-5p检测略有下降。

分析本研究结果，我们认为，血清miR-34a-5p、miR-4709-3p均有一定的鉴别PTC与良性甲状腺结节的效能，且血清miR-34a-5p效能略优于miR-4709-3p。但考虑到本研究纳入样本量较少，病例收集的范围较局限，对于诊断试验的评价及分析结果有一定的波动性，后期应扩大样本量，进行多中心、大样本的更加稳定的评价试验。虽然本研究结果尚不能说明血清miR-34a-5p可单独用于PTC的早期诊断，但以上研究结果为早期PTC无创诊断方法的相关研究提供了新的补充和提示。未来可进行大样本及甲状腺细针穿刺标本实验，扩大并完善预后价值的分析，并可联合更多特异的miRs进行检测，或联合多模态超声检查及其他无创诊断方式进行诊断价值分析，采用多中心实验验证以上结论，继续筛选和发现其他具有研究价值的生物标志物，指导精准医疗。