凝胶色谱-多角度激光光散射法测定聚对二氧环己酮绝对分子量及分子量分布指数

彭 健,施燕平,刘 叶,沈 永,刘莉莉,陈 方

(1.山东省医疗器械和药品包装检验研究院,济南 250101;2.国家药品监督管理局生物材料器械安全性评价重点实验室,济南 250101;3.山东省医疗器械生物学评价重点实验室,济南 250101)

聚对二氧环己酮(PPDO)是由对二氧环己酮聚合而成的高分子聚合物,分子链上有醚键,具有较高的柔韧性和抗张强度[1]。由PPDO 制成的医疗产品,如可吸收手术缝合线、面部提拉线、生物可吸收支架、止血钳、止血膏、缝合线夹、药用筛网和医用黏合剂等[2-6],具有优异的生物相容性、可吸收性和生物可降解性,被广泛应用于医学领域。该类产品在体内的降解产物会经代谢作用排出体外,对人体无危害性及毒副作用,效果优于传统材料制品[7]。PPDO 相对分子质量及分子量分布指数[D,重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)的比值]会影响PPDO产品的力学性能,而聚合物相关测定方法通常为黏度法和凝胶色谱法(GPC)。前者无法获得D,后者需要采用标准品聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯(PS)等校准,但PMMA、PS的空间构象和PPDO 的存在差异,不能真实反映PPDO的绝对分子量。激光光散射法是一种非破坏性、无需校正的检测相对分子质量和分子尺寸的方法,散射光强度正比于待测分子的绝对分子量、含量、折光指数增量的平方,散射光角度只与分子尺寸相关。将凝胶色谱法和多角度激光光散射仪联用,不仅能分离出样品中不同组分,还可在不依赖标准品的前提下得到PPDO 的Mw、Mn、D、均方根旋转半径(Rg)、分子构象和聚集态等[8-11],为PPDO 绝对分子量的准确测定提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260 Infinity 型凝胶色谱仪,配G1311C 型四元泵、G1329B 型自动进样系统和G1316A 型柱温箱;Optilab T-r EX 型示差折光仪和DAWN HELEOS-Ⅱ型18角度激光光散射仪,软件分别采用Astra 5.3.4和Astra 6.1;ME3002E/02型电子天平。

PMMA 归一化标准溶液:取相对分子质量为22 800的PMMA 标准品10.2 mg,用流动相溶解并稀释,配制成2 g·L－1PMMA 归一化标准溶液。

六氟异丙醇(HFIP)的纯度为99.5%;三氟乙酸钠的纯度为97%;相对分子质量分别为602,2 160,5 980,12 900,22 800,41 400,88 500,202 000,520 000,988 000,1 510 000,2 200 000 的PMMA标准品的纯度均为100%;PPDO 面部埋植线(外购)产品批号分别为1924301X、CB19041903、CB19041502、CB19 041501;试验用水为纯化水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱仪

Shodex HFIP 805(300 mm×8.0 mm,6μm)/Shodex HFIP 803(300 mm×8.0 mm,6μm)串联色谱柱;柱温40 ℃;流动相为含0.01 mol·L－1三氟乙酸钠的HFIP溶液(使用前用0.22μm 聚四氟乙烯滤膜过滤并超声30 min);流量1.0 mL·min－1;进样量50μL。

1.2.2 示差折光仪

用流动相冲洗仪器至基线稳定,使基线噪音稳定在±7.5×10－10RIU(折射率单位)附近;溶剂为流动相;检测波长690 nm;流量1 mL·min－1;进样量1 mL;用Astra 5.3.4软件采集数据。

1.2.3 多角度激光光散射仪

依次使用过滤后的纯化水、异丙醇、甲苯冲洗仪器至激光信号稳定;流量1 mL·min－1;进样量1 mL;使用甲苯对激光常数进行测定,激光常数4.395 5×10－5;用Astra 6.1软件采集数据。

1.3 试验方法

1.3.1 折光指数增量的测定

取0.253 4 g PPDO 样品,用流动相溶解并稀释,配制成5.068 g·L－1PPDO 样品储备溶液。取适量上述溶液,用流动相逐级稀释,配制成质量浓度分 别 为0.851 76,1.729 8,2.557 8,3.382 8,4.226 3 g·L－1的PPDO 样品溶液系列。按照示差折光仪工作条件测定,以PPDO 的质量浓度为横坐标,对应的示差响应信号为纵坐标绘制标准曲线,所得斜率值即为折光指数增量,结果为0.185 3 mL·g－1,用于计算PPDO 的绝对分子量。

1.3.2 绝对分子量、Rg和D的测定

取适量PPDO 样品,用流动相逐级稀释,配制成质量浓度为4 g·L－1的PPDO 样品溶液,用0.45μm滤膜过滤,滤液中各组分按照色谱仪工作条件分离。用相对分子质量为22 800的PMMA 归一化标准溶液对激光光散射仪的不同角度相对于90°进行归一化校正,以修正光电二极管灵敏度及几何形状差异。按照多角度激光光散射仪工作条件测定色谱仪分离得到的目标产物,同时参考文献[10-11],采用光散射法测定绝对分子量的公式,计算Mw、Mn、Rg和D。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

PPDO 在常用溶剂三氯甲烷、四氢呋喃等中无法溶解,加热的条件下可溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)中,无法适用常温下的光散射法测试。HFIP极性较高、黏度较大,在常温下即可快速溶解PPDO[12],因此试验选择以HFIP作流动相,并在其中添加三氟乙酸钠至其质量浓度达到0.01 mol·L－1,以降低流动相黏度和色谱柱压力,增强PPDO 的分离效果。

2.2 色谱柱的选择

试验考察了串联色谱柱A(Shodex HFIP 805/Shodex HFIP 803,相对分子质量排阻范围1 000～600 000)和串联色谱柱B(2根PL1114-6900 HFIP色谱柱串联,相对分子质量排阻范围100～2 000 000)对样品分离效果的影响,结果见图1。

图1 样品在不同串联色谱柱下的光散射色谱图Fig.1 Light scattering chromatograms of the sample on different columns

由图1可知,以串联色谱柱B 分离时,样品的光散射色谱峰前端有一个干扰峰,因此试验选择以Shodex HFIP 805/Shodex HFIP 803串联色谱柱进行色谱分离。

2.3 样品溶液质量浓度对Mw 测定的影响

样品溶液质量浓度的选择很关键,样品溶液质量浓度过高时,样品溶液黏度较大,易黏附在色谱柱上,导致色谱柱过载,峰形变差,甚至出现平头峰,结果稳定性较差。因此,试验考察了PPDO 样品(1924301X)溶液质量浓度分别为0.5,2,4,8 g·L－1时对Mw测定的影响,每个质量浓度的样品溶液均平行测定6 份,计算Mw的相对标准偏差(RSD),结果见表1。

表1 不同质量浓度PPDO 样品溶液下Mw 及其RSD(n＝6)Tab.1 Mw and RSD with different mass concentrations of PPDO sample solutions(n＝6)

由表1可知,Mw随着PPDO 样品溶液质量浓度的增加而降低,样品溶液的质量浓度为4 g·L－1时Mw的RSD 较小,且此时PPDO 色谱峰峰形较好。

按照试验方法分析同质量浓度的4 种PPDO样品溶液,Mw、Mn和D结果见表2。

表2 不同批号PPDO 样品的Mw、Mn 和D 及其RSDs(n＝6)Tab.2 Mw,Mn,D and their RSDs of different batches of PPDO samples(n＝6)

由表2可知,Mw、Mn和D测定值的RSD 分别小于3.0%,5.0%和4.0%,说明此质量浓度所得的测定结果的稳定性较好,因此试验选择制备的样品溶液的质量浓度为4 g·L－1。

2.4 聚合物分子半径以及构象的确定

Rg随Mw变化的曲线见图2,其中纵坐标为对数坐标。

图2 Rg 随M w 的变化曲线Fig.2 Curves showing the change of Rg with M w

结果显示,PPDO 在HFIP 中的Rg在20～70 nm 内。基于文献[13]的研究结果,当Rg随Mw变化的曲线的斜率为1时,聚合物为棒状结构,其分子长度与Rg、Mw成正比;斜率为0.5～0.6时,聚合物为无规线团结构,分子末端距与Rg、Mw1/2成正比;斜率为1/3 时聚合物呈球形,球体半径与Rg、Mw1/3成正比。本试验所得斜率为0.55,表明PPDO为无规线团结构,分子链呈卷曲构象,这有利于增加PPDO 埋植线的柔顺性。

2.5 方法比对

按照色谱仪工作条件测定由1.1节中12个不同相对分子质量的PMMA 标准品制成的PMMA标准溶液(1 g·L－1,稀释剂为流动相),以tR为横坐标,lgMW为纵坐标进行三次拟合回归,所得回归方 程 为y＝－0.002 892x3＋0.170 5x2－3.618x＋30.88,相关系数为0.999 7。取适量样品(1924301X),用流动相稀释,配制成4 g·L－1样品溶液,按照色谱仪工作条件测定,代入回归方程,所得Mw、Mn和D 分别为204 372,148 347,1.968,远高于本方法的测定结果(表2),这是由于PMMA 与PPDO 的分子结构存在差异,由PMMA 校准得到的结果不能反映样品的真实情况。

本工作利用GPC 和多角度激光光散射仪联用法测定PPDO 的绝对分子量及D,该方法不依赖任何假设和标准曲线,且精密度好、操作简单,可对以PPDO 为原料的产品的质量控制以及安全性评价提供技术参考。