当归的形态变化特征与物质积累进程△

武伟国，蔡子平，王国祥*，王波

1.甘肃省农业科学院 中药材研究所/甘肃省中药材种质改良与质量控制工程实验室/甘肃省名贵中药材驯化与种苗繁育工程中心，甘肃 兰州 730070；

2.兰州海关技术中心 食品安全实验室，甘肃 兰州 730000

当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels 为伞形科（Umbrelliferae）当归属多年生草本植物，以根入药，味甘、辛，性温，含藁本内酯、α-蒎烯等不饱和烃、醇、醚、醛、酮、酚、酸、酯、磷脂、多糖和氨基酸等多种成分，具有调血活血、调经止痛、润肠通便等功效，为临床使用频率最高的中药之一[1]。当归在我国地理分布广泛，具有岷归、川归和云归等多个道地品种，主产区位于甘肃，约占全国产量的70%[2]。

当归的形态变化特征与物质积累进程受遗传特性、环境条件和栽培措施等因素的共同影响，而这方面的研究仅有少量文献报道[3-6]。本研究旨在探讨当归形态特征与药效成分含量变化、物质积累进程的关系，揭示当归产量与品质形成机制，为当归规范化种植提供参考。

1 材料

1.1 样品

样品为2018 年甘肃省定西市岷县闾井镇农户所育，经冬季窖藏后，于移栽前进行挑选，由甘肃省农业科学院中药材研究所龚成文研究员鉴定为当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels 种苗。种苗根长（8.00±1.50）cm，根粗（4.50±0.50）mm，根鲜质量（0.50±0.10）g。药材硫基长效配方肥购于甘肃施可丰生态科技有限公司，N、P2O5和K2O质量分数分别为20%、15%和10%。

1.2 仪器

Secura 224-ICN 型分析天平（德国赛多利斯公司）；SP-756P 型紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）。

1.3 试药

对照品阿魏酸（批号：D0009741，纯度≥99%）、Z-藁本内酯（批号：RFS-G01001909023，纯度≥98%）均购于上海麦克林生化科技有限公司；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 田间试验

移栽试验于2019 年4 月至11 月进行，6 次重复，株行距7.5 cm×40.0 cm，小区面积11.5 m×4.0 m，种植于道地产区甘肃省定西市渭源县会川镇半阴坡村。各小区当归的出苗率＞80%，抽薹率＜6%，且差异无统计学意义。试验区海拔2500 m，气候高寒阴湿，昼夜温差大，年平均气温4.7 ℃，年平均降水量650 mm，无霜期130 d，土壤类型为黑垆土。试验地土壤有机质质量分数37.1 g·kg-1、速效钾质量分数215 mg·kg-1、速效磷质量分数59.6 mg·kg-1、碱解氮质量分数250 mg·kg-1，pH 为7.77，于移栽前基施1200 kg·hm-2药材硫基长效配方肥。2019 年试验区气温和10 cm深土壤地温变化趋势见图1。

图1 2019年当归田间试验试验区气温和地温变化趋势

2.2 形态性状测定

2019 年5 月30 日至11 月10 日，每个小区每隔20 d 挖取长势均一的植株30 株，将茎叶与根部分离并清洗泥土后晾干，测定每个植株的叶数、株高、叶鲜质量、根长、根粗和根鲜质量形态性状并取相应的平均值，叶片枯萎变干后不计入茎叶部分，株高以最大叶片叶基至叶片中心的距离为依据。自然阴干后测定30 株植株混合样品的叶干质量和根干质量。

2.3 品质性状的测定

2019 年5 月30 日至11 月10 日，每个小区每隔20 d 挖取长势均一的植株30 株，取根部洗涤干净后带回实验室，自然阴干后粉碎（过60 目筛），测定30 株植株混合样品的浸出物、挥发油、有机酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本内酯质量分数。

2.3.1 浸出物与挥发油的测定 参照《中华人民共和国药典》2020 年版方法，以70%乙醇为溶剂，采用热浸法测定浸出物质量分数，采用水蒸气蒸馏法测定挥发油质量分数[7]。

2.3.2 有机酸与多糖含量测定 于25 ℃以50%乙醇超声辅助提取有机酸，以1 mol·L-1HCl酸化提取液至pH 为2 左右，以正丁醇萃取有机酸。移取有机酸提取液5 mL，以酚酞为指示剂，以0.1 mol·L-1NaOH 标准溶液滴定，以溶液由无色变为红色时为滴定终点。以柠檬酸为基准计算有机酸质量分数。于70 ℃下采用蒸馏水浸提多糖，以Sevage试剂［三氯甲烷-正丁醇（4∶1）］脱蛋白。移取多糖提取液1 mL，依次加入6%苯酚1 mL、蒸馏水1 mL 和浓硫酸5 mL，静置10 min 后，摇匀，室温放置30 min，以纯水样品为空白对照，于485 nm 测定吸光度。以葡萄糖为基准计算多糖质量分数，标准曲线方程为Y=0.066 6X-0.030 0，r=0.999 9，Y表示485 nm 处的吸光度，X（mg·L-1）表示葡萄糖的质量浓度。

2.3.3 阿魏酸和Z-藁本内酯含量测定 采用高效液相色谱法测定阿魏酸和Z-藁本内酯的含量。

2.3.3.1 对照品溶液制备 精密称取阿魏酸3.75 mg和Z-藁本内酯10.00 mg，以含5%甲酸的甲醇溶解后转入50 mL量瓶中，定容至刻度，则得含75 mg·L-1阿魏酸和200 mg·L-1Z-藁本内酯的对照品溶液，使用时按所需倍数稀释。

2.3.3.2 供试品溶液制备 取当归粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，经0.45 µm 滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3.3.3 色谱条件 采用Agilent Extend C18色谱柱（250mm×4.6 mm，5µm）；流动相0.1%甲酸甲醇溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～3 min，10%～15%A；3～12 min，15%～45%A；12～30 min，45%～65%A；30～35 min，65%～80%A；35～40 min，80%～90%A，40～45 min，90%～10%A）；柱温为30 ℃；检测波长为280 nm；流速为0.2 mL·min-1；进样量为2µL。对照品溶液与供试品溶液的高效液相色谱图见图2。

图2 对照品及当归供试品溶液的高效液相色谱图

2.3.3.4 检出限与定量限 分别精密量取对照品溶液适量，以含5%甲酸的甲醇倍比稀释，按2.3.3.3项下条件测定，以信噪比（S/N）≥3 计算检出限，以S/N≥10 计算定量限。阿魏酸和Z-藁本内酯的检出限分别为0.015、0.040 mg·L-1、阿魏酸和Z-藁本内酯的定量限分别为0.050、0.120 mg·L-1。

2.3.3.5 线性范围 分别精密量取对照品溶液10、25、50、100、250 µL 并移入50 mL 量瓶中，以含5%甲酸的甲醇定容至刻度。按2.3.3.3 项下条件测定，对峰面积和对照品的质量浓度作回归分析。结果表明，阿魏酸质量浓度在0.015 0～0.375 0 mg·L-1与峰面积线性关系良好，Z-藁本内酯质量浓度在0.040 0～1.000 0 mg·L-1与峰面积线性关系良好。阿魏酸的标准曲线方程为Y=21 255X-116.67（r=0.999 8）；Z-藁本内酯的标准曲线方程为Y=9 800.7X+90.37（r=0.999 3）。

2.3.3.6 精密度试验 精密量取对照品溶液适量，按2.3.3.3 项下条件连续测定6 次。阿魏酸和Z-藁本内酯质量分数的RSD 分别为2.18%和1.94%，表明仪器精密度良好。

2.3.3.7 稳定性试验 精密量取供试品溶液适量，分别于室温下放置4、8、12、16、18、24 h，按2.3.3.3项下条件测定。24 h内阿魏酸和Z-藁本内酯质量分数的RSD 分别为2.65%和2.78%，表明溶液稳定性良好。

2.3.3.8 重复性试验 精密称取当归样品粉末适量，共6 份，按2.3.3.2 项下方法制备供试品溶液，按2.3.3.3 项下条件测定。阿魏酸和Z-藁本内酯质量分数的RSD 分别为1.86%和2.15%，表明方法重复性良好。

2.3.3.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的当归样品粉末适量，共6 份，分别加入一定质量浓度的对照品溶液适量，按2.3.3.2 项下方法制备供试品溶液，按2.3.3.3 项下条件测定，计算加样回收率，结果见表1。阿魏酸和Z-藁本内酯的回收率分别为98.93%和96.60%。

表1 当归中阿魏酸和Z-藁本内酯的加样回收率

2.4 数据处理

公式（1）中，y0为偏移因子，A为面积因子，w为宽度因子，tc为中心因子；公式（2）中，k为饱和因子（容量因子），a为初始因子，b为速率因子。根据公式（2）的二阶微分方程，可以将积累进程划分为3 个阶段，即起始期、指数期和稳定期，以d2y/d2t=0.01kb2对应的时间为起始期开始时间，以d2y/d2t=-0.01kb2对应的时间为稳定期结束时间，以d3y/d3t=0 对应的时间为指数期开始与结束时间[8]。

3 结果

3.1 当归形态特征的变化过程

当归叶数、株高、叶鲜质量、叶干质量和叶干物质质量分数的变化过程见图3～4。由图3 可知，当归的叶数和株高随时间均呈先递增后递减的变化趋势，这与老叶枯萎新叶新生相关。叶数从40 d 的3 片升至120 d 的9 片，再降 至200 d 的2片。株高从40 d 的8.37 cm 升至140 d 的53.87 cm，再降至200 d 的32.48 cm。由图4 可知，当归的叶鲜质量和叶干质量随时间均呈先递增后递减的变化趋势。叶鲜质量从40 d的1.39 g升至140 d的165.90 g，再降至200 d 的31.49 g。叶干质量从40 d 的0.25 g升至140 d 的25.52 g，再降至200 d 的9.76 g。当归的叶干物质质量分数随时间呈先递减后递增的变化趋势，从40 d的17.93%降至140 d的15.38%，再升至200 d的31.09%。

图3 当归叶数及株高的变化趋势（, n=6）

图4 当归叶质量及干物质质量分数的变化趋势（, n=6）

当归根长、根粗、根鲜质量、根干质量和根干物质质量分数的变化过程见图5～6。由图5 可知，当归的根长和根粗随时间均呈递增的变化趋势。根长从40 d的9.11 cm 升至200 d 的35.41 cm。根粗从40 d 的4.93 mm 升至200 d 的32.09 mm。由图6 可知，当归的根鲜质量和根干质量随时间均呈递增的变化趋势。根鲜质量从40 d 的0.68 g 升至200 d 的124.29 g。根干质量从40 d 的0.14 g 升至180 d 的38.30 g，再略微降至200 d 的38.01 g。当归的根干物质质量分数随时间呈先递减后递增再递减的变化趋势，从40 d的20.12%降至60 d的19.51%，再升至160 d的34.78%，再降至200 d 的30.54%。

图5 当归根长及根粗的变化趋势（, n=6）

图6 当归根质量及干物质质量分数的变化趋势（, n=6）

当归茎叶与根部的鲜质量、干质量和干物质质量分数比例的变化过程见图7。由图7可知，当归的根叶鲜质量比、干质量比随时间呈先递减后递增的变化趋势。根叶鲜质量比从40 d 的0.49 降至80 d 的0.18，再升至200 d 的4.05。根叶干质量比从40 d的0.55 降至60 d 的0.21，再升至200 d 的3.96。当归的根叶干物质质量分数比随时间呈先递增后递减的变化趋势，从40 d 的1.13 升至140 d 的1.88，再降至200 d的0.98。

图7 当归根叶鲜质量比、干质量比和干物质质量分数比的变化趋势（, n=6）

3.2 当归药效成分的变化过程

当归浸出物、挥发油、有机酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本内酯含量的变化过程见表2。

浸出物和挥发油是控制芳香类中草药质量的重要指标[9]。由表2 可知，当归的浸出物含量随时间呈先递增后递减再递增的变化趋势。浸出物质量分数从40 d的40.33%升至200 d的58.83%。当归的挥发油含量随时间呈先递增后递减的变化趋势。挥发油质量分数从40 d的0.49%升至180 d的1.66%，再降至200 d的1.26%。

表2 当归浸出物、挥发油、有机酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本内酯的质量分数（, n=6） %

表2 当归浸出物、挥发油、有机酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本内酯的质量分数（, n=6） %

注：同列不同小写字母表示P＜0.05。

当归总有机酸主要包括丁二酸、壬二酸、癸二酸、茴香酸、肉蔻豆酸、樟脑酸、阿魏酸、烟酸、香草酸、正二十四酸、棕榈酸等，具有很强的抗氧化活性和抗菌活性[10]。多糖作为一类生物大分子，具有广泛的生物学活性。当归多糖由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等成分组成，对机体免疫系统、造血系统等有明显作用，在抗肿瘤、抗放射性损伤上有良好疗效[11-12]。由表1 可知，当归的有机酸含量和多糖含量均随时间呈递增的变化趋势。有机酸质量分数从40 d 的6.47%升至200 d 的11.39%。多糖质量分数从40 d的17.25%升至200 d的19.26%。

阿魏酸是当归有机酸的代表成分，Z-藁本内酯是当归中具有重要生理活性的成分[13]，其常被作为当归的药效标志物。由表1 可知，当归的阿魏酸含量和Z-藁本内酯含量均随时间呈递增的变化趋势。阿魏酸质量分数从40 d 的0.050% 升至200 d 的0.081%。Z-藁本内酯质量分数从40 d 的0.31%升至200 d的1.13%。

3.3 当归物质积累进程的非线性拟合

茎叶生物量y（g）随时间t（d）呈先增大后减小的趋势，以高斯方程为模型进行拟合。根部生物量、浸出物、挥发油、有机酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本内酯y（g）等随时间t（d）均呈增大的趋势，以逻辑斯蒂方程为模型进行拟合。

拟合方程及统计分析见表3。由表3 可见，对于茎叶生物量，R2＞0.950 0，χ2（5）＜χ20.01（5）=15.09（P＜0.01），F（4,5）＞F0.01（4,5）=11.39（P＜0.01）；对于根部生物量、浸出物、挥发油、阿魏酸和Z-藁本内酯，R2＞0.950 0，χ2（6）＜χ20.01（6）=16.81（P＞0.01），F（3,6）＞F0.01（3,6）=9.78（P＜0.01），因此，拟合精度和拟合优度均很好。

表3 当归生物量及药效成分积累进程的拟合方程及统计分析（n=9）

时间分界及各时期的特征见表4。由表4 可知，浸出物、挥发油、有机酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本内酯的积累进程的3 个阶段与根部生物量有很高的重叠性。

表4 当归生物量及药效成分积累进程的时期划分及各时期的特征

4 结论与讨论

4.1 当归成药期生长发育期的划分

根据当归茎叶及根部的生长状况，当归成药期生长过程可初步划分为5 个阶段：出苗期（0～20 d，移栽至5 月中旬）、茎叶缓慢生长期（20～60 d，5 月中旬至6月中旬）、茎叶旺盛生长期（60～120 d，6月中旬至8月中旬）、根部旺盛生长期（120～160 d，8月中旬至9 月中旬）和根部稳定生长期（160～200 d，9 月中旬至11月中旬）。

4.2 当归成药期物质积累规律

生物量的积累与分配过程从表象上反映了植物的生长发育过程。0～20 d 期间，根部提供营养以供基芽生长，生物量有所消耗。20～60 d，茎叶及根部生物量的积累速度均较慢，这一阶段主要发生不定根及侧根的构建过程；60～120 d，茎叶生物量的积累速度较快，而根部生物量的积累速度较慢，这一阶段茎叶的快速生长为光合作用创造条件。120～200 d，茎叶及根部生物量的积累发生2 次质变。在120 d 左右，根部生物量的积累速度超过茎叶生物量，这时气温开始＜20 ℃。在150 d 左右，根部生物量超过茎叶生物量，实现了生物量主要分配区从茎叶到根部的过渡，这时气温开始＜15 ℃。特别是在140 d左右，茎叶生物量的积累进入衰退期，这与老叶开始枯萎有关，在160 d左右，根部生物量的积累进入稳定期。

浸出物、挥发油、有机酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本内酯的积累是当归次生代谢过程的主要表现，在整个观测期，其质量分数分别增加了18.50%、0.76%、2.02%、4.93%、0.03%和0.82%，且积累进程的3 个阶段与根部生物量的重叠性很高，即其积累从属于根部生物量。