环境内分泌干扰物双酚A对雌性生殖的影响

吴雨珂，陆 祥，任艳萍，孙少琛

(1.南京农业大学 动物科技学院，江苏 南京 21009；2.遵义医科大学 基础医学院，贵州 遵义 563099)

环境内分泌干扰物(EEDs)是一种广泛存在于人类生活中的环境污染物，通过环境暴露或饮食摄入等途径对人体内分泌系统造成影响[1-2],干扰机体用于维持内环境稳态所需的内分泌激素的合成、分泌乃至最终代谢消除的一种物质[3]。有研究证实，长期的EED暴露对于人和动物的健康可能存在危害，一些环境内分泌干扰物还可能通过模拟或抵抗类固醇激素合成酶的作用，干扰受体信号转导，进而扰乱雌激素、雄激素等关键生殖激素的正常生理作用，最终对机体的生殖系统运转产生不利影响[4-5]。其中，双酚A(BPA)是较为常见且毒性较大的一种EED。

双酚A属于合成树脂类的环境内分泌干扰物，是一种被广泛应用于生产聚碳酸酯塑料和环氧树脂的人造高分子聚合物，是很多食品包装内衬,甚至是牙齿密封剂的组成成分[6-7]。这类聚合物经高温或酸碱分解后产生的BPA单体极易扩散至周围环境，因此现代人受BPA影响是十分普遍的[8]。Chen等[9]研究发现，BPA具有弱的类雌激素作用，BPA暴露会通过非经典的雌激素触发途径产生雌激素作用，具有拟雌激素和抗雄激素的作用。一定剂量的BPA暴露可能会影响生殖内分泌甚至引发幼儿性早熟，对人和动物的生殖系统产生永久性的伤害。近年来，相关报道称BPA对于哺乳动物两性生殖系统均会产生不利影响，因此，BPA暴露对于机体健康的影响受到各界的广泛关注。诸多研究证实，BPA具有致子宫、卵巢、卵泡等异常的毒性[1]，其对于卵母细胞发育的影响更是目前研究的热点问题。

本文将从BPA的生殖毒性入手，简述BPA暴露对哺乳动物生殖系统的影响，针对其对卵母细胞质量的影响及相关预防措施做出综述，以期为未来相关研究提供参考。

1 双酚A暴露对子宫的影响

子宫肌收缩对胎儿的娩出有重要意义，但妊娠期间，为了防止胎儿流产或早产，子宫肌的收缩会受到抑制[10]，因此不正常的子宫肌收缩可能导致不孕症的发生[11]。Liliana等[12]研究家猪的子宫内壁发现，即便是低剂量的BPA暴露，也可能会导致子宫内壁平滑肌收缩异常，这可能是由于BPA激活了子宫肌细胞中钾离子通道和鸟苷酸环化酶信号通路所致；而Kabakci等[13]在研究中用不同浓度BPA对猫的子宫组织进行体外处理，首次证明BPA对于猫子宫组织自发收缩的频率和强度均存在抑制作用，这种抑制作用可能会导致雌性哺乳动物不育症的发生。此外，BPA体外处理大鼠子宫细胞的实验结果同样表明，BPA显著抑制细胞收缩，这可能是由于BPA激活了后叶垂体素相关信号通路，转而抑制了前列腺素相关的信号通路的表达造成的[14]。由于BPA和雌二醇的分子结构相似，都可以和子宫内膜中的雌激素受体结合，竞争性抑制子宫内膜中雌激素与受体的结合，影响子宫的发育，对子宫造成不可逆的损害[15]。研究表明，BPA暴露会导致啮齿类动物子宫雌激素受体α(ESR1)降低，进而影响子宫上皮增殖[16]。此外，BPA处理还会导致大鼠子宫上皮细胞凋亡，对子宫内膜细胞增殖造成不利影响[17]。另外，BPA还会导致孕鼠子宫内膜腺体和基质组织异常分布在脂肪组织中，这可能是由于BPA诱导了ER和Hoxa10基因的表达所致[18]。

由于子宫是胎儿发育的最主要场所，体内BPA暴露会导致子宫不能正常发挥生理功能，对胎儿生殖系统发育造成很大影响。围产期暴露于BPA环境下会导致子宫紧密连接蛋白表达的减少，影响胚胎附殖。Watkins等[19]在临床样本中，首先测定了受试母亲妊娠前、中、后期孕尿中的BPA水平，并于8～14年后测定其对应男性后代血清中的性激素水平及性器官成熟度等指标，比对结果显示妊娠不同阶段的子宫内BPA暴露与青春期前后男性生殖发育呈负相关。此外，还有研究表明[20-21]，子宫内BPA暴露会干扰哺乳动物的乳腺发育，增加乳腺肿瘤发生的风险。

上述实验研究证明了子宫内外的BPA暴露都可能对母体健康，甚至是后代发育造成不利影响，然而确切的干扰机制仍需更多研究加以探求。未来的研究可以从妊娠阶段BPA暴露的潜在窗口期等方面着手进行。

2 双酚A暴露对卵泡的影响

卵巢中卵泡的正常发生以及性腺激素的产生对于雌性动物获得受孕的能力有至关重要的意义[22]。因此,BPA对于卵泡发育的影响是当下研究热点之一。雌性哺乳动物在出生前后形成原始卵泡库，其中有限的原始卵泡数决定了其一生的排卵次数是有限的。Rodríguez等[23]研究表明，初生小鼠皮下注射20 mg/kg bw BPA会促进其原始卵泡过度激活，导致原始卵泡数减少。王喜艳等[22]将小鼠的腔前卵泡与不同剂量BPA进行体外共培养，研究发现45 μmol/L的BPA暴露对于腔前卵泡的发育具有明显抑制作用。

此外，卵泡的发生过程是由各种激素共同参与调节的，其中如雌激素等生殖激素对卵泡和卵母细胞发育的影响尤为重要，激素分泌异常可能会对卵泡及卵母细胞成熟造成阻碍[24]。王喜艳等[25]在体外培养小鼠腔前卵泡的实验中发现，45 μmol/L的BPA暴露可以抑制卵泡合成雌激素，阻碍卵母细胞的成熟；而Rodríguez等[23]研究发现BPA暴露会导致招募卵泡过程中雌激素受体数增加的现象，这也可能是导致原始卵泡数减少的原因之一。研究表明，围产期暴露于BPA可引起后代大鼠卵巢发育异常，具体表现为雌激素受体ERβ改变，血清雌激素升高，进而导致卵巢中闭锁卵泡增多[26]。上述实验结果证明了BPA会对卵泡发生及原始卵泡数造成影响，这对于雌性动物的生殖能力存在很大的影响。今后的研究方向可以更加着眼于BPA剂量和卵泡数目减少之间关系；此外，暴露于BPA可诱导卵巢颗粒细胞凋亡[27]，导致卵巢DNA损伤，BPA也可通过抑制HDAC7的蛋白表达影响卵巢功能和卵泡发育[28]。而BPA介导的生殖激素水平的变化对于卵泡发生的影响也有待进一步研究。

卵巢疾病如多囊卵巢综合征(PCOS)等不仅会引发生殖障碍[29]，严重者如卵巢癌等更是具有极高的危险性，因此卵巢致病因子也是当下研究的热点之一。Wang等[30]研究表明，PCOS患者卵泡液中BPA浓度较高，抑制了卵泡颗粒细胞中芳香化酶的表达以及雌激素的合成，这可能是PCOS患者的发病机制之一；而Zhou等[31]研究表明，BPA暴露可能与患者囊状卵泡减少有关，这可能会对PCOS患者卵巢功能造成影响。此外，注射BPA显著导致大鼠在成年后卵巢中出现大量的囊肿，显著影响大鼠生育能力，这可能是由于BPA暴露干扰了下丘脑-垂体-性腺轴的功能和激素的正常分泌，从而造成成年后多囊卵巢综合症[32]。机制上的研究发现BPA暴露导致睾酮合成的限速酶基因17β-HSD mRNA和雌二醇合成的限速酶基因芳香化酶mRNA表达明显降低，影响了LH、FSH 及 E2 等激素水平，造成脑垂体对性激素的负反馈作用的敏感性下降，干扰了下丘脑-垂体-卵巢轴的调节[33]。虽然上述实验研究表明，BPA暴露可能与当下频发的卵巢相关的生殖疾病存在一定联系，但是部分疾病比如PCOS的发病机制仍不明朗，因此未来还需要更多相关研究结果阐明其影响机理。

3 双酚A暴露对卵母细胞质量的影响

卵母细胞的质量可以通过其减数分裂成熟度、受精能力以及受精后的胚胎发育状况进行评定，而BPA暴露能够对卵母细胞质量造成影响，从而影响到其成熟、受精能力以及后续的胚胎质量。

3.1 干扰卵母细胞减数分裂的进行 卵母细胞的成熟要经过减数分裂，分裂过程中各个环节受到干扰都可能对卵母细胞质量造成影响。Zhang等[34]对实验鼠进行了连续7日，每日100 μg/kg bw的BPA体内暴露实验，之后对卵母细胞减数分裂进程进行监测，结果显示，BPA会通过扰乱正常减数分裂过程中纺锤体集合、染色体分布及染色体微管连接，干扰第一极体的排出，进而对卵母细胞的核成熟造成消极影响。此外，Campen等[8]将牛的COCs暴露在不同剂量的BPA环境中进行体外培养，研究证实了BPA 暴露会通过影响纺锤体形成以及染色体排布，对卵母细胞成熟产生危害，且这一影响呈现出随BPA剂量加大而增强的剂量效应。其余类似研究[35]也通过不同动物的体内外实验验证得出了相似结论，即 BPA可以通过诱发第二次减数分裂期间纺锤体畸形导致卵母细胞质量和发育潜能下降。体外实验显示BPA会导致GDF-9和BMP-15表达，破坏卵母细胞减数分裂[36]。BPA对卵母细胞成熟质量的影响与其诱导的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)产生有关，BPA导致卵母细胞发生氧化应激，进而诱导的细胞凋亡和自噬，最终影响卵母细胞减数分裂进程[34-37]。

综上所述，不同剂量的BPA暴露会造成减数分裂过程中纺锤体、染色体等活动异常，进而干扰减数分裂的进行，影响卵母细胞质量，而更加详细的作用机制还需要更多实验数据加以证明。

3.2 干扰卵丘细胞功能 卵丘细胞是由颗粒细胞分化而来的一种功能细胞，其在卵母细胞发育过程中不仅起到保护作用，也可以促进卵母细胞减数分裂的进程[38-39]。先前研究证据显示[40]，卵丘细胞的凋亡会影响卵母细胞质量。Mansur等[41]在人颗粒细胞体外培养实验的研究结果中表明，高浓度的BPA暴露会减少CDC20，BUB1B和HAS2的基因表达，而增加TRIB3和LUM基因表达，导致卵丘细胞凋亡增加，进而对卵母细胞成熟造成影响。

此外，卵丘细胞会与卵母细胞建立细胞间缝隙连接通讯(GJIC)，形成卵丘卵母细胞复合体(COCs)，进而调控卵母细胞的减数分裂和分化[42]。有研究证实[39,43-44]，不同剂量的BPA在不同动物体内和体外多个系统中都会以GJIC作为作用位点，这会导致排卵的过程受到扰乱，进而影响卵母细胞成熟。Acua-Hernández等[35]通过分离小鼠排卵前的COCs与不同浓度的BPA进行体外共培养，研究表明，BPA可能会通过阻碍COC的胞间交流，加快减速分裂进程，导致卵母细胞由减数第一次分裂前期过渡到减数第二次分裂中期时转化受损，最终影响卵母细胞质量。

上述实验结果证明了BPA存在卵丘细胞毒性，会影响卵丘扩张及GJIC影响卵母细胞的成熟，为进一步研究BPA对雌性生殖系统的影响具有一定参考价值。

3.3 影响卵母细胞表观遗传学修饰 表观遗传学是基因和环境互作导致的表型效应。研究表明，卵母细胞发育过程受到组蛋白修饰、DNA甲基化等表观遗传学修饰的影响[45]。Wang等[46]收集经BPA处理体外成熟至MⅠ期的卵母细胞，对其进行免疫荧光染色后对组蛋白赖氨酸甲基化水平进行检测，结果显示H3K4me2和5mC均与DNA存在共定位现象，其表达水平的降低可能会通过扰乱卵母细胞的DNA甲基化水平，进而抑制卵母细胞成熟。Zhang等[47]对雌性鲦鱼分别进行连续7天和14天，每天15μg/L的BPA处理后对卵巢进行性腺指数测定，研究表明，不同剂量的BPA处理会对CpG岛不同遗传位点造成甲基化修饰，抑制相关基因表达，导致雌激素合成元件对雌激素受体募集减少，降低机体雌激素水平，最终影响卵巢机能，阻碍卵母细胞成熟。Santangeli等[48]基于BPA对斑马鱼生殖相关基因表达影响的研究结果表明，BPA暴露会导致促卵母细胞成熟信号转导受到抑制，这一现象可能与组蛋白修饰导致的染色质结构改变有关。此外，Yu等[49]进行的鸡胚内BPA暴露实验结果显示，Dazl和Stra8基因发生了低甲基化修饰，会对原始卵泡库的形成造成影响。

经上述研究初步证实，BPA可以通过影响部分基因的表观遗传学修饰抑制其表达，进而阻碍卵母细胞的成熟，这对研究BPA的分子作用机理提供了一定的理论支持。然而，表观遗传学修饰对于抑制生殖相关基因表达的详细作用机理还需要进一步研究加以探究。

3.4 降低卵母细胞的受精能力 受精是一个由多个步骤组成，具有特异性的生命活动，是有性繁殖动物发育的起始[50]。受精能力也被视作评定卵母细胞质量高低的指标之一。哺乳动物的受精过程包括精子的获能、获能精子结合并穿过透明带、与卵黄膜融合，最终形成受精卵。研究证实，小鼠卵母细胞ZP2蛋白碱基末端是精子在透明带上的结合位点，而皮质层释放的ovastacin蛋白可以促使受精后卵母细胞ZP2蛋白裂解，以防多精子入卵的情况发生[51-52]。Zhang等[34]在小鼠的BPA体内实验中发现，BPA处理的卵母细胞精子结合率较低，随后研究证实BPA暴露会导致小鼠未受精的卵母细胞中ovastacin的定位错误以及过早释放，加速ZP2蛋白的裂解，导致精子因失去结合位点而无法穿越透明带；此外，卵黄膜上存在的Juno蛋白是精卵结合过程中卵黄膜融合的关键蛋白[53]；Zhang等[34]在研究中还发现BPA暴露会破坏小鼠Juno蛋白在卵黄膜上的定位，导致其数量减少，影响卵黄膜融合反应的进行，最终导致了卵母细胞受精能力的下降。

由此可知，BPA可以通过影响卵母细胞外层结构上的精卵结合位点，对卵母细胞受精能力产生不利影响；而是否存在其他由BPA导致的基于卵母细胞的损伤导致其受精能力下降的情况，以及BPA剂量对卵母细胞受损程度的影响，还有待后续进一步探索。

4 卵母细胞BPA暴露对胚胎和后代发育的影响

受精后的卵母细胞在子宫附植之前还要经历一系列生理过程，一般称为早期胚胎的发育。早期胚胎发育的成功与否很大程度上取决于其发育环境以及应对环境变化的能力，因此囊胚发育率可以作为评定体外成熟卵母细胞质量的指标。Ferris等[54]将BPA处理的牛卵母细胞进行体外成熟培养，实验结果显示受精前卵母细胞暴露在30 ng/mL的BPA下会导致后期囊胚率显著降低，细胞凋亡增加以及性别比例失调等问题。相似的研究也表明，BPA会导致小鼠非整倍性受精卵和胚胎的增加，进而影响了早期胚胎发育并导致流产，这可能是由于BPA降解了中心体蛋白从而扰乱了纺锤体微管组织和染色体分离造成的[55]。孕鼠皮下注射40 mg/kg/day的BPA导致小鼠胚胎植入延迟和围产期死亡率的增加，40 mg/kg/day的BPA暴露则导致小鼠胚胎胚胎在输卵管内滞留和胚胎发育延迟[56]。此外，研究发现双酚类物质能够影响HOX和APO家族基因表达，进而破坏人类分化早期胚胎的脂质代谢过程[57]。研究证实，BPA可以通过胎盘在胎儿体内积累，影响胎儿发育和内分泌功能[58]，此外，母体围产期暴露于BPA导致胚胎附植减少。孕期暴露BPA可降低子代雌鼠卵巢甲基转移酶的表达，导致子代DNA过度甲基化，损害生殖发育[59]。

上述结果表明受BPA干扰的卵母细胞形成的胚胎质量及发育潜能也受到影响，这为BPA暴露对卵母细胞质量的影响提供了又一个研究方向。但类似的实验较少，因此，胚胎质量减少是否存在其他因素干扰，还需要进一步研究证实。

5 双酚A对雌性生殖系统侵害的保护措施

褪黑素又名N-乙酰基-5甲氧基色胺，是一种由松果腺释放的内分泌激素，与生命体生物钟的调节以及季节性繁殖活动等都有很大关联[60-61]。先前研究证实，褪黑素具有强抗氧化性，可以清除绝大多数氧自由基[62]。Zhang等[34]在实验中通过让小鼠口服BPA和褪黑素发现，褪黑素可以通过修复BPA造成的部分损伤，增加第一极体排出率以及抑制细胞凋亡提升卵母细胞质量，并且可以起到保护卵母细胞的作用。此外，Park等[63]用0.1 μM的Mito-TEMPO处理了经75 μM的BPA预处理22 h的体外成熟猪卵母细胞，实验结果表明褪黑素处理不仅可以修复BPA暴露引起的COCs卵丘扩张程度降低，还能够减少BPA引起的线粒体蛋白凋亡。这一研究首次证明了褪黑素可以通过对线粒体机能的调控，抑制BPA的超氧化作用，并减少卵母细胞氧化应激，进而起到促进卵母细胞成熟的作用，但对于其具体机制及剂量效应等相关内容还有待进一步研究加以探讨。

姜黄素(Curcumin,CRC)属于天然存在的植物化学物质，是姜黄根状茎的活性成分。作为一种天然的抗氧化剂。BPA暴露后明显增加了小鼠卵巢的活性氧水平，造成氧化应激，并导致卵巢中有腔卵泡闭锁比例升高。姜黄素处理后挽救了小鼠卵巢的氧化应激和卵巢中有腔卵泡闭锁情况。这一研究还发现BPA暴露降低了卵巢超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)以及过氧化氢酶(CAT)的表达和活性，姜黄素逆转了BPA 诱导的 3 种抗氧化酶表达和活性的下降。因此，姜黄素可通过逆转BPA诱导的氧化应激进而缓解卵巢氧化损伤，或许可以作为BPA毒性的重要保护措施之一[64]。

辅酶Q10是一种有效的抗氧化剂，据报道可减轻由多种毒物引起的损伤。辅酶Q10显著降低BPA诱导的生殖细胞凋亡、磷酸化检查点激酶1(CHK-1)水平、双链断裂(DSB)和减数分裂卵母细胞染色体缺陷水平。辅酶Q10也挽救了双酚A诱导的氧化应激水平、线粒体功能障碍和抗氧化酶基因表达水平。辅酶Q10处理还降低了非整倍体胚胎和BPA诱导的胚胎早期分裂缺陷的水平。因此，辅酶Q10可以通过清除活性氧和自由基来对抗BPA引起的雌性生殖的毒性[65]。此外，研究还发现维生素E和人参总甙均对BPA暴露导致的氧化应激具有挽救作用，进而缓解对雄性小鼠生殖系统的损伤[66-67]。因此，我们推测，缓解BPA致雌性生殖系统的损伤存在多种途径，天然抗氧化剂或许可以构成一种低风险、低成本的策略。

6 展望

近年来，面临生殖方面问题的人数呈现逐年递增的趋势，其中女性卵母细胞质量下降的问题不容忽视。此外，随着科学技术的不断发展，胚胎移植等辅助生殖技术在人类医学和畜牧生产中都得到广泛应用，这也进一步引发了各界对于卵母细胞质量影响因素的广泛关注。BPA作为一种广泛存在日常生活中的环境内分泌干扰物，其具有的生殖毒性对于卵母细胞质量的影响不可小觑。本文综合阐述了BPA的生殖毒性，对其致卵母细胞质量下降的因素做出了深入探讨，并总结和讨论了近年来对于BPA毒性的预防及保护作用的相关研究。然而关于BPA对于卵子质量是否存在其他影响还有待进一步研究证实，其他预防及保护措施也亟需深入探究。