大鼠血浆中硝苯地平及氧化硝苯地平浓度的LC-MS测定方法

兰 雪,陈曾妮,周旭美,3,4,韩敏珍,唐富山,3,4

(1.遵义医科大学 药学院临床药学教研室，贵州 遵义 563099；2.贵州医科大学 第二附属医院药剂科，贵州 凯里 556000；3.遵义医科大学 基础药理教育部重点实验室、特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099；4.遵义市临床药学重点实验室，贵州 遵义 563006)

药物-药物、药物-食物相互作用导致药物血药浓度异常波动时，就可能诱发不良事件的发生，这不仅与合理用药的宗旨相违背，甚至可能危及患者的生命安全[1-2]。大部分的药物相互作用主要发生在药物代谢环节，而药物对细胞色素P450(CYP)酶的影响是药物相互作用最主要和常见的原因。药物对CYP酶的影响可通过探针药物法等多种方式进行评价，寻求可用于评估药物相互作用的探针药物研究方法至关重要[3-4]。在CYP酶系中，50%的药物经CYP3A酶代谢，硝苯地平是CYP3A酶的特异性底物，可在人体内代谢转化为氧化硝苯地平[5]。以硝苯地平作为探针药物，通过研究硝苯地平及其代谢物氧化硝苯地平的药动学可以评估有关药物对CYP3A酶活性的影响，从而预测可能的药物相互作用[6]。虽然已有文献报道关于测定硝苯地平及其代谢物氧化硝苯地平血药浓度的方法，但在血浆样品处理、取材的方式方法、色谱条件选择等方面仍有待优化。因此，本实验建立并优化了测定大鼠血浆中硝苯地平及其代谢产物氧化硝苯地平的血药浓度的LC-MS方法，并进行了初步的药动学研究验证。

1 材料

1.1 仪器 液相色谱仪购自岛津公司(型号：20XR AD)，质谱仪购自ABSCIEX公司(型号：API4000 Qtrap)，配置有电喷雾离子源。高速冷冻离心机Thermo Fisher购自德国(型号：D-3570Osterode),纯水仪购自瑞飞乐生物科技有限公司(型号：S5PXC0501)。

1.2 药品与试剂 硝苯地平原料药(购自广州优瓦仪器有限公司，批号：100338201404，纯度：99.0 %)。硝苯地平对照品(购自中国食品药品检定研究院，批号：100338，纯度：99.9%)。氧化硝苯地平对照品(购自西格玛集团有限公司，批号：043M3903V，纯度：99.5%)。尼群地平对照品(购自中国食品药品检定研究院，批号：100585-201104，纯度：99.0%)。乙醚、乙酸乙酯、正己烷等试剂为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。流动相甲醇为色谱纯，购自国药集团化学试剂有限公司。水为纯水仪自制去离子水。

1.3 实验动物 健康成年SD大鼠6只，雄性，SPF级，体重(220±20)g，购自重庆第三军医大学实验动物中心，动物许可证号为SCXK(渝)2017-0005。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 对照品储备液 分别精密称定硝苯地平、氧化硝苯地平、尼群地平对照品，用甲醇溶解后定容，分别配制成质量浓度为390.00、90.00、10.00 μg/mL的储备液，密封于棕色容量瓶中，置于-20 ℃冰箱中保存。用于配制标准曲线的储备液均由浓度为390.00、90.00、10.00 μg/mL的硝苯地平、氧化硝苯地平、尼群地平溶液逐步稀释，质控样品(溶液)独立称取，配制。

2.1.2 硝苯地平的淀粉浆混悬液的配制 取60 mL蒸馏水水浴加热至85 ℃，加入柠檬酸0.6 g，搅拌使之溶解，加入可溶性淀粉1.2 g，持续搅拌，加入硝苯地平原料药，搅拌均匀，待冷却，供大鼠灌胃给药用。

2.1.3 标准曲线所需样品溶液的配制 取硝苯地平对照品储备液适量，用甲醇稀释，配制成硝苯地平质量浓度分别为5.27、4.40、3.30、1.65、8.25×10-1、8.25×10-2、8.25×10-3μg/mL的标准曲线样品。另取一份硝苯地平对照品储备液适量，用甲醇稀释配制成浓度为8.25×10-3μg/mL的定量下限(Lower limit of quantitation，LLOQ)样品。取氧化硝苯地平对照品储备液适量，用甲醇稀释，配制成氧化硝苯地平质量浓度分别为66.67、33.33、6.67、3.33、6.67×10-1、6.67×10-2、6.67×10-3ng/mL的标准曲线样品。另取一份氧化硝苯地平对照品储备液适量，用甲醇稀释配制成浓度为6.67×10-3ng/mL的LLOQ样品。

2.1.4 质控溶液的配制 取硝苯地平对照品储备液适量，分别用甲醇稀释，配制成硝苯地平质量浓度分别为4.40、3.30、1.65×10-2μg/mL的QC溶液。取氧化硝苯地平对照品储备液适量，分别用甲醇稀释，配制成氧化硝苯地平质量浓度分别为46.67、4.67×10-1、2.00×10-2ng/mL的质控溶液。

2.2 血浆样品的处理

2.2.1 对照品样品处理方法 取空白血浆100 μL，加入硝苯地平对照品溶液25 μL，加入氧化硝苯地平对照品溶液10 μL，加入10.00 μg/mL尼群地平10 μL，1 mol/L氢氧化钠100 μL，涡旋20 s，加入乙酸乙酯-正己烷(3∶1)混合液1 000 μL，涡旋30 s，5 000 r/min离心5 min，取800 μL上清液，55 ℃水浴氮吹，吹干后用色谱甲醇150 μL复溶，涡旋20 s，14 000 r/min冷冻离心10 min，取上清液进样100 μL。

中职学校的晚自习时间，很少能看到学生在教室里学习。其原因很多，除了学生缺乏学习动机、学习习惯未养成外，很可能与其学习风格有关。在中职生群体中，独立型学习风格属于被忽略的学习风格，可见中职生不喜欢独立、自主的学习方式，而喜欢合作与体验。

2.2.2 血浆样品处理方法 取大鼠血浆样品100 μL，加入10.00 μg/mL尼群地平10 μL、1 mol/L氢氧化钠100 μL，涡旋20 s，加入乙酸乙酯-正己烷(3∶1)混合液1 000 μL，涡旋30 s，5 000 r/min离心5 min，取800 μL上清液，55 ℃水浴氮吹，吹干后用色谱甲醇150 μL复溶，涡旋20 s，14 000 r/min冷冻离心10 min，取上清液100 μL进样。

2.3 分析测定条件

2.3.1 色谱条件 色谱柱Gemini 3 μm C18 110A(New Column 50×2.0 mm)，保护柱Security Guard Cartridges(GeminiC18 4×2.0 mm ID)，色谱柱与保护柱均购自phenomenex公司。柱温(40 ℃)，流动相A：甲醇；流动相B：水，采用梯度洗脱，洗脱程序如表1所示，流速(0.6 mL/min)，取1 μL样品进样分析。

表1 梯度洗脱条件

2.3.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源(ESI)；离子喷射电压：-5 000 V；温度：550 ℃；源内气体1(GS1，N2)压力：55 psi；气体2(GS2，N2)压力：55 psi；气帘气体(CUR、N2)压力：40 psi；正离子模式检测；扫描模式为多重反应监测(MRM)；定量离子对等质谱条件如表2所示，硝苯地平、氧化硝苯地平、尼群地平对照品质谱图分别如图1～3所示。

图1 硝苯地平对照品质谱

表2 质谱条件

2.4 分析方法验证

2.4.1 专属性 分别取6个来源不同的空白血浆100 μL，用等体积的甲醇代替内标溶液，按照“血浆样品处理”项的方法操作，得色谱图4A，取空白血浆，分别加入QC溶液，按“血浆样品处理”项方法操作，得色谱图4B～D，采集一只用药1 h后的大鼠血浆样品，按“血浆样品处理”项操作，得色谱图4E。图4所示结果表明，氧化硝苯地平、硝苯地平和尼群地平的保留时间分别为2.35、2.52和3.02 min。空白血浆中的内源性物质不干扰硝苯地平、氧化硝苯地平和内标化合物的测定。

图2 氧化硝苯地平对照品质谱

图3 尼群地平对照品质谱

A：空白血浆；B：空白血浆+氧化硝苯地平对照品；C：空白血浆+硝苯地平对照品；D：空白血浆+尼群地平对照品；E：给药大鼠生物样品。

2.4.2 线性范围 按“2.2.1 对照品样品处理方法”项的方法处理标准曲线样品。以血浆中分析物的理论浓度为横坐标，以分析物与内标峰面积的比值为纵坐标，用最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程为标准曲线。硝苯地平典型线性方程为：硝苯地平的回归方程Y=133.58×10-2X+0.08×10-2，R2=0.9 917。氧化硝苯地平典型线性方程为：Y=1.89×10-2X+0.09×10-2，R2=0.999。标准曲线各浓度点的测定浓度和理论浓度的相对误差(RE)均不超过±15%，相关系数(r)均大于0.99。结果表明，标准曲线线性良好，测定血浆中硝苯地平的线性范围为8.25 ng/mL～5.27 μg/mL。氧化硝苯地平的线性范围为6.67 pg/mL～66.67 ng/mL。

2.4.3 定量下限 按“2.2.1 对照品样品处理方法”项方法处理LLOQ样品，每个分析批共6个样品，连续3个分析批。分别根据同批标准曲线计算LLOQ样品的浓度，并计算其RE、批内相对标准偏差(RSD)、批间RSD，结果见表3、表4。所有LLOQ样品所测定的浓度与理论浓度的RE在±20%之内，且批内、批间RSD不超过20%[7]。结果表明，本法测定血浆中硝苯地平的定量下限为8.25 ng/mL，氧化硝苯地平的定量下限为6.67 pg/mL。

表3 硝苯地平精密度与准确度结果

表4 氧化硝苯地平精密度与准确度结果

2.4.5 提取回收率 按“2.2.1 对照品样品处理方法”项方法处理低、中、高3个浓度的QC血浆样品，每个浓度6个样品，进样所得峰面积分别除以空白血浆经处理后再加入低、中、高6个浓度的QC溶液及内标溶液后进样所得峰面积，即为血浆中硝苯地平和氧化硝苯地平的提取回收率。硝苯地平在低、中、高3个浓度血浆样品中的提取回收率分别为(103.22±10.71)%、(105.84±8.24)%、(104.34±5.72)%，硝苯地平的相对回收率在103.22%～105.84%。氧化硝苯地平在低、中、高3个浓度血浆样品中的提取回收率分别为(91.00±3.41)%、(101.27±9.31)%、(100.95±4.10)%，硝苯地平的相对回收率在103.22%～105.84%。

2.4.6 基质效应 按“2.2.1 对照品样品处理方法”项处理6个不同来源的空白血浆，分别加入低、中、高3个浓度的QC溶液及内标溶液，每个浓度有6个样品，进样所得峰面积记为A。以相应浓度的QC溶液及内标溶液直接进样所得峰面积记为B。以不同来源样品的面积A除以相应浓度面积B的平均值，即为血浆中内源性物质对硝苯地平、氧化硝苯地平和内标尼群地平的基质效应因子(Matrix factor，MF)。以硝苯地平、氧化硝苯地平与尼群地平MF的比值计算内标归一化基质效应因子，同时以多个样品获得的内标归一化基质效应因子计算变异系数RSD。结果见表5，不同浓度测定结果的RSD均不超过15%，表明本方法可以忽略基质对于样品测定结果的影响[7]。

表5 硝苯地平及氧化硝苯地平基质效应结果

2.4.7 稳定性 取硝苯地平23.75 μg/mL、89.06 ng/mL质量浓度的QC样品，每个浓度3个样品。氧化硝苯地平630.00、0.27 ng/mL质量浓度的QC样品，每个浓度有3个样品。分别考察含药血浆室温放置6 h，进样器下放置8 h，-80 ℃反复冻融3次，-80 ℃放置10 d的稳定性。结果如表6、表7所示。

表6 硝苯地平样品稳定性结果

2.5 药动学研究应用

2.5.1 动物试验方案 将6只大鼠禁食不禁水12 h，次日灌胃给予硝苯地平的淀粉浆混悬液(给药剂量为25 mg/kg)，分别于给药后0.17、0.5、1、2、4、6、8、10、14、24、28、32、36 h于眼底静脉丛取血0.3 mL，置于肝素涂壁的1.5 mL离心管中，3 500 r/min离心5 min，取上清液(血浆)于另一个离心管中，存放于-80 ℃保存。

2.5.2 未知样品测定 按“血浆样品的处理”项方法处理未知血浆样品，每个分析批均随行一条标准曲线，均匀分布QC样品。各分析批标准曲线中各浓度点和所有随行的QC样品的测定浓度与理论浓度之间的RE均在±15%之内，并且直线回归方程的相关系数(r)均大于0.99。

2.5.3 药动学参数计算及血药浓度时间曲线 经bapp 2.0软件计算，药动学参数见表8。6只大鼠分别灌胃给予硝苯地平及代谢产物氧化硝苯地平的平均浓度时间-曲线见图5、6。

表8 药动学参数结果

图5 硝苯地平平均血药浓度-时间曲线

图6 氧化硝苯地平平均血药浓度—时间曲线

3 讨论

文献报道[8-11]，硝苯地平血浆样品可通过加入乙腈、甲醇、乙醚、二氯甲烷-正己烷(3∶7)、乙酸乙酯等进行前处理。由于生物样品的血药浓度较低，内源性物质易残留，使用沉淀蛋白的方法不仅升高基质效应，还会缩短色谱柱的寿命[12]。本文通过按不同配比乙醚、乙酸乙酯、正己烷液液萃取法进行血浆样品前处理，发现乙酸乙酯-正己烷(3∶1)时，提取回收率高，对主峰无干扰，血浆杂质少，重现性好。因此，本实验选择了乙酸乙酯-正己烷(3∶1)进行液液萃取来提取目标物质。通过液液萃取的方法，使检测下限进一步降低，提高了检测方法对生物样品的定量的适用性和精确性。另外由于目标物为弱碱性[13-14]，故在液液萃取前碱化血样，使药物较多以非解离型存在，可增大提取物在有机相中的溶解度，从而提高回收率。由于生物样品中内源性物质较多，故采用梯度洗脱的方法，通过梯度变换流动相(甲醇-水)的比例，保证在每次进样过程中，均可实现高比例水相和有机相的洗脱，从而改善峰型，减少拖尾，延长色谱柱寿命[15]。同时，在色谱柱前连接保护柱，可提高柱效，使测定结果更加稳定、准确。

本实验通过对大鼠不同时间点取血进行药物代谢动力学检测，对比发现，眼眶取血法比心脏取血法在本实验中更具优势。心脏取血时，使用水合氯醛对大鼠进行麻醉，试验中存在弊端，如：大鼠需要5～10 min才能进入麻醉状态，在未麻醉状态下取血困难，容易错过最佳取血时间；麻醉剂量不易掌握，致死率较高；大鼠在麻醉后约0.5～1 h 苏醒，严重影响大鼠的正常生理状态，从而影响药物代谢，难以获得准确、完整实验数据。因此本实验采取眼眶取血法，取血前用乙醚进行麻醉，麻醉时间快，方法简单，容易操作。用毛细管取血完成后，大鼠立即醒来，恢复正常活动、饮水、饮食，且死亡率低，并且能够准确掌控取血时间点，有利于获取完整、准确的血药浓度数据。

文献报道了CYP3A酶系是重要的药物代谢酶，通过测定硝苯地平及其代谢产物氧化硝苯地平的血药浓度，预测可能的药物-药物、药物-食物相互作用[16-18]。本文建立的测定大鼠血浆中硝苯地平及氧化硝苯地平血药浓度的LC-MS方法具有专属性强，灵敏度高，分析速度快的特点，可用于硝苯地平大鼠药物代谢动力学研究。相对于其他研究[19-21]，硝苯地平的定量下限进一步降低，可满足生物样本中血药浓度测定的要求。同时，本研究建立了硝苯地平代谢产物氧化硝苯地平的血药浓度测定方法，可更好地适应以硝苯地平为探针研究药物对肝药酶活性影响及药物相互作用研究的需要。