遗传转化技术在药用植物研究中的应用

黄恻隐，李 林，闻伟锷，李小妹，徐德林

(遵义医科大学 细胞生物学教研室，贵州 遵义 563099)

我国具有丰富的中药材资源，500多种常用中药材已有近一半开展了人工种植，例如大宗药材三七、丹参和当归已几乎全部来源于栽培[1]。中药材具有副作用相对较小、资源分布广、价格适宜的特点，对疾病的整体诊疗以及对慢性病、疑难病症也具有独特的治疗效果[2]。而通过遗传转化技术可以实现中药材品种改良，以及探究中药材的药用活性成分的分子合成机制，为中药材产业的持续健康发展提高技术支持。

植物遗传转化(Plant genetic transformation)是利用重组DNA技术和细胞组织培养技术将外源基因导入植物基因组中使植物获得新性状的技术。遗传转化研究最早广泛应用于水稻、小麦、番茄、拟南芥和烟草等经济作物和模式植物中，以改良植物品种和研究基因调控功能为目的。随着人们对中医药促进健康的重视，以及满足民族中药材产业健康持续发展的需求，生产出高产优质的中药材是发展中药材产业的基本物质保障。研究调控中草药生长发育和药用活性成分合成积累的遗传机制，推进转基因技术、代谢工程等生物技术在中药材研究中的应用是大势所趋，也是促进中药材产业现代化升级的必经之路。然而，目前很多药物植物仍存在转基因技术应用少和进展缓慢的情况。

借助在模式植物上的成熟研究思路和技术方法，通过解析调控植物生长发育和次生代谢产物合成的代谢机制，改良药用植物品种和提高其药用活性成分合成积累的目的[3-4]。本文综述了近年有关遗传转化技术在药用植物研究中的应用，探讨了该技术在药用植物研究中尚存在的主要问题，并对技术的发展趋势与进一步应用进行了展望，以期为中草药的生长发育规律揭示与药用活性成分的合成生物学研究提供借鉴。

1 植物遗传转化方法与影响因素

植物遗传转化是利用细胞组织培养和基因克隆等技术，有目的地将外源基因插入植物基因组中获得稳定表达的转基因植物的技术[5-6]。遗传转化方法包括基因枪法、电击法、超声波法、显微注射法、PEG法、花粉管通道法、农杆菌介导法和DNA病毒载体介导法。其中农杆菌介导法、基因枪法和花粉管通道法在植物中应用最为广泛[7-8]，这3种遗传转化方法的优缺点和影响因素存在明显差异(见表1)。在这3种方法中，农杆菌介导法的影响因素较多，不仅对遗传转化受体有较高的要求，还需构建起系统的遗传转化体系，但该方法存在靶点性更明确，更有助于目标基因功能实现的优点，更适用于中草药中遗传背景较清晰的单个或少数基因的功能分析。而基因枪法的靶向性较弱但转化率高，可适用于几乎全部的药用植物。花粉管通道法受到更多的非人为因素影响，重复性和转化率均较低，在药用植物中的应用易受限制。尽管如此，3种方法均被成功应用于药用植物的研究中。

表1 三种遗传转化方法的比较

1.1 遗传转化方法在药用植物中的应用 农杆菌介导法(Agrobacterium-mediated transformation method)是通过农杆菌侵染植物细胞的过程中将外源基因整合到农杆菌质粒上的T-DNA，再通过T-DNA插入到受体植物基因组中获得转基因植株的方法，由于其转化方法具有操作简便和转化效率高的优点，因此在植物遗传转化中应用较多[9]。研究发现，通过农杆菌介导法将川乌Ac-F3'5'H基因转化到矮牵牛中，发现该基因可催化合成蓝色花色素[10]。在铁皮石斛甾醇C-24甲基转移酶2基因的功能研究中，通过根癌农杆菌介导法将该基因转化到烟草中，发现烟草中的谷甾醇含量得到了显著提高[11]。

基因枪法(Gene gun bombardment)是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒的表面，利用加速装置将微粒射入受体细胞，而微粒上的外源DNA将随机整合到受体细胞的基因组中，从而实现外源基因转化的方法[12]。王瑛等[13]通过基因枪法将大麦lea3基因转入紫花苜蓿的胚性愈伤组织中，从而获得了具有较强耐盐能力的转基因紫花苜蓿植株。由于基因枪转化法存在成本高、不利于外源基因在宿主细胞中稳定表达的特点，使得其在药用植物的遗传转化研究较少。

花粉管通道法(Genetic transformationviapollen-tube pathway)是授粉后使外源的基因沿着花粉管进入胚囊后转化受精卵细胞，从而将外源基因整合到植物基因组中的方法[14]。花粉管通道法存在操作简便，缩短育种时间，可用于所有开花植物的优点；但也存在受环境影响大，易形成多位点整合的缺点，使得其在药用植物的研究也较少[15]。在荔枝的转基因育种研究中，王树军等[16]首次将花粉管通道法成功应用于荔枝中的外源基因转化。

1.2 遗传转化影响因素 植物遗传转化过程中，转化效率受多种环境状况和培养条件等因素的影响，农杆菌介导法、基因枪法和花粉管道法的影响因素存在着差异。

1.2.1 农杆菌介导法的影响因素 农杆菌介导法的物理影响因素包括培养基pH值、温度、光照、水分，化学影响因素包括培养基成分、诱导剂、表面活性剂，其他影响因素有农杆菌菌株类型、侵染浓度、侵染时间、抗生素浓度、宿主类型、受体基因型和受体生长状态等，这些因素都与转化效率密切相关[17-18]。在红腺忍冬的遗传转化体系优化研究中发现，叶片是最适宜外植体，30 mg/L是抗生素头孢霉素的最适宜浓度[19]。姜育松等[20]在研究钩藤发根的高效诱导体系中发现，农杆菌C58C1对其茎、嫩叶和老叶3种外植体的诱导率都超过了80%，其中嫩叶最高达到了91.8%，同时发现B5培养基最适于钩藤发根的生长和2种生物碱的积累。在丹参遗传转化研究中，张林甦等[21]优化了丹参叶片和茎快速诱导愈伤组织生成的培养基配方，以及愈伤组织生根的培养基配方，建立与优化了以10 mg/L链霉素为筛选剂通过农杆菌GV3101侵染5 min、共培养1 d的高效遗传转化体系。刘闵豪等[22]在研究农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系中，筛选出了愈伤组织诱导不定芽和不定芽复壮的最适培养基配方，确定了预培养5 d、侵染10 min、共培养3 d以及3/4 MS+0.054 μmol/L NAA+4.4 μmol/L 6-BA+200 mg/L Cef+70 mg/L Km为筛选培养基的高效丹参遗传转化体系。不同物种的各阶段培养方式以及提高遗传转化率的过程都存在差异，但可发现在植物愈伤组织侵染中时间不宜太长，过长可能抑制愈伤组织增殖和分化，共培养2～3 d后进行筛选培养，筛选过程中需添加适宜浓度的筛选剂和抑制农杆菌的抗生素，这些都是建立与优化农杆菌介导的遗传转化体系的关键影响因素。

1.2.2 基因枪法的影响因素 基因枪法的影响因素包括受体类型、轰击前后培养条件、基因枪的轰击参数、DNA浓度、DNA沉淀剂、微弹用量、微弹速度、微弹射程、培养基成分等，这些因素都影响着其转化的效率[7]。陈禹先等[23]对微载体的选择、制备、包埋、点膜和轰击参数进行了优化，并对抗生素选择培养基和受体细胞处理等进行了系统研究，显著提高了微藻的遗传转化效率。在蛹虫草通过基因枪法进行遗传转化的研究中发现，以金粉包裹载体pDHt-gpd A-GFP-bar，在靶距离6 cm或9 cm，氦气压力7.58×106Pa或8.96×106Pa的条件下，经草铵膦抗性筛选，成功获得了2个遗传稳定的转化子[24]。基因枪介导的遗传转化方法受多种因素影响，其成本高和操作更为复杂，使得基因枪法的应用在药用植物中很少。

1.2.3 花粉管通道法的影响因素 花粉管通道法主要受外源基因转化途径、转化受体细胞和转化时间等因素的影响，这些因素都与其转化效率密切相关[25]。Agus等[26]通过组织化学和分子分析的方法研究了麻风树花粉管直接转化的效率，发现不同基因型麻风树通过花粉管的转化效率存在着差异。冼康华等[27]采用花粉管通道法对铁皮石斛进行转基因技术研究，发现以含有GFP和GUS基因的质粒为载体进行转化，可以获得更高的结实率。在花粉管通道法介导的植物遗传转化研究中发现，基因型和授粉时间等因素对转化效率的影响至关重要，同时使用不同的载体也会得到不同的效果。

2 药用植物遗传转化的应用概况

目前，遗传转化研究的药用植物有黄连[28]、虎杖[29]、杜仲[30]、黑果枸杞[31]、流苏石斛[32]和甘草[33]等，这些药用植物的研究成果也为其他药用植物开展遗传转化研究提供了参考。现阶段还有很多药用植物的遗传转化研究尚未开展，已开展的研究中也是农杆菌介导的转化系统应用较为广泛，利用其他遗传转化方法转化成功的报道还比较少。而药用植物遗传转化的研究主要应用于品种改良、基因沉默和代谢工程等主要领域。

2.1 品种改良 通过遗传转化技术能显著提高药用植物的产量、抗病性、抗虫性、抗菌性和抗逆性等[34]，从而获得品质更好的转基因植株[35]。农杆菌介导法和基因枪法在药用植物转基因育种研究中也应用成功，获得了质量更好和产量更高的中药材优良品种[36]。例如，张振华等[37]通过转入抗病毒基因CyMB-CP到石斛中，优化了根癌农杆菌介导的遗传转化体系，为培育抗病毒石斛新品种提供了材料基础。邱璐等[38]用基因枪法将水稻RBBI2-3基因转移到灯盏花中，并对其遗传转化体系进行优化，成功获得了具有较强抗虫和抗真菌的灯盏花转基因植株，提高了花的产量和品质。Zeng等[39]在花椒中建立了农杆菌介导的再生和遗传转化系统，为进一步进行品种改良和基因功能分析奠定了良好的基础。Azadi等[40]用农杆菌介导法将无毒的黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)复制酶基因转入百合中获得了CMV抗性很强的百合植株。Zhang等[41]将一个NAC转录因子CcNAC1基因通过农杆菌介导法整合到黄麻的基因组中，发现过表达CcNAC1的黄麻植株对干旱的耐受性显著增强，从而鉴定出了CcNAC1为干旱胁迫耐受性的正调控因子。

2.2 基因沉默 基因沉默(Gene silencing)是生物体内特定基因的不表达或者表达降低的现象。RNA干扰广泛存在于生命体中，是一种在转录后水平上的序列特异性基因沉默，该技术广泛应用于药用植物的代谢工程中可通过在生物和细胞内导入小干涉RNA后引起同源mRNA的降解而使得目的基因沉默[42]。

amiRNA(Artificial microRNA)是一种诱导目的基因发生特异性沉默的技术，amiRNA在转化植物中对目标靶基因的沉默具有较高的特异性，人工设计出的不同amiRNAs在所转化株系中的沉默效率也存在不同[43]。基因沉默主要应用于探究药用植物中关键基因的调控功能，以进一步解析关键基因在生长发育和次生代谢产物合成积累中的分子调控机制。王健等[44]选取丹参的1个R2R3 MYB类转录因子基因SmPAP1为研究对象，设计并构建相应的amiRNA基因干涉载体对SmPAP1进行特异性沉默，在阳性转化株系中发现了与酚酸代谢途径紧密相关的关键酶基因表达显著下调以及总酚酸含量下降的现象，进一步说明了SmPAP1作为一个重要的转录因子参与了丹参酚酸类活性物质的代谢调控。黄兴琳等[45]通过构建FAD3基因的RNA干扰表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化将其导入到了紫苏中，发现阳性植株中FAD3基因的表达受到了显著抑制。在甘草阿魏酸5-羟化酶(Ferulate 5-hydroxylase，F5H)基因的研究中，通过前期转录组测序发现该基因在甘草酸生物合成中起负调控作用，以甘草胚轴为外植体通过农杆菌介导法诱导了F5H基因过表达和沉默毛状根，UPLC检测发现F5H基因沉默的毛状根的甘草酸含量显著提高，从而证实了F5H基因在甘草酸生物合成的负调控作用[46]。

2.3 代谢工程 植物次生代谢产物包括萜类、酚类和含氮化合物3类，广泛参与了植物的生长、发育和防御等生理过程，在植物的生命活动过程中发挥着重要作用。药用植物的有效成分大多是次生代谢产物，其含量很少，利用栽培措施很难提高其有效成分的含量，而通过转基因技术来调节基因表达和酶合成能有效提高药用植物次生代谢产物的合成[47-48]。例如，陈尘等[49]在药用植物丹参基因组中克隆丹参COI1基因并初步分析其蛋白特征及表达模式，进而利用RNAi技术和农杆菌介导的遗传转化法构建了丹参COI1基因沉默株系，检测发现丹参COI1基因参与调控了丹参主要次生代谢产物合成和积累的过程。Figlan等[50]通过不同的根癌农杆菌诱导丹参毛状根，发现转基因的毛状根与丹参体内生物活性物质的产生存在密切的相关关系。Ma等[51]通过克隆青蒿AaHDR1基因构建过表达载体和反义抑制载体进而获得遗传转化的青蒿植株，发现AaHDR1基因的过表达增加了青蒿素、青蒿素B和其他倍半萜以及多个单萜的含量，而反义抑制其基因则导致了相反的结果，表明AaHDR1不仅促进青蒿素的积累，也对其他萜类物质的合成具有重要作用。Shi等[52]同时过表达ADS、CYP71AV1、ALDH1和CPR四个青蒿素生物合成途径的基因，并通过农杆菌介导的遗传转化方法，发现青蒿素的含量得到了显着增加。

3 展望

药用植物种类繁多，但受生长年限长和植株有效成分含量低的限制，药用植物的产业发展缓慢。药用植物遗传转化前期主要应用于抗逆、抗病等研究，以提高产量和质量为目的。而现在，药用植物遗传转化更多应用于研究次生代谢产物生物合成的调控机制，以实现次生代谢产物在特定组织或细胞中的定向合成，也为后期的生物合成和化学合成提供理论基础[53]。

农杆菌介导法具有操作简便、成本低的优点，使其在药用植物的遗传转化研究中应用较广泛，但药用植物仍存在转化效率很低以及进展缓慢的状况，这都是目前亟待解决的问题。在药用植物遗传转化研究中，CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用逐渐增多，该技术具有显著提高遗传转化体系高效性和稳定性的优点[54]。目前，基于磁性纳米材料作为载体将外源基因转入植物细胞中的遗传转化技术也开始应用，其纳米材料对植物没有伤害，也更有利于将外源基因转入到植物基因组，有效提高了遗传转化的效率，而该技术在药用植物中的应用较少[55-56]。在基于磁性纳米颗粒作为基因载体的棉花遗传转化研究中，发现在花粉中通过磁珠可以将外源基因成功导入到棉花基因组中，并建立了在棉花、辣椒和南瓜的子代中也稳定表达的高效遗传转化系统[57]。纳米材料具有较高的转化效率、良好的生物相容性、对外源基因的充分保护以及较强的植株再生的潜力[58]。因此，基于磁性纳米颗粒的遗传转化技术在药用植物中将具有很大的应用前景。

基因工程技术在改良药用植物、丰富药用植物种质资源以及提高药用活性成分含量的研究中有着良好的发展前景。而且，药用植物遗传转化的发展也将推动植物生物反应器生产药用活性成分的产业化发展。本综述对药用植物的遗传转化研究进行了系统总结梳理，以期对中药材资源的合理开发利用、药用活性成分代谢途径的解析和药活性成分的定向合成提供理论基础。