血睾屏障与男性避孕

孟志翔 吕金星

1.苏州大学附属独墅湖医院；2.苏州大学附属独墅湖医院生殖医学中心

一、介绍

血睾屏障（BTB）本质是生精小管与睾丸血液之间的一层屏障，由间质的毛细血管内皮基膜、结缔组织、生精上皮基膜、生精细胞及支持细胞通过紧密连接、胞质特化、桥粒和缝隙连接等连接复合体相互作用所形成[1-4]。其特有的微观结构，为精子发生提供了适宜的微环境，并参与调节生物分子的运输以及作为精子发生的免疫屏障[5]。血睾屏障对男性生育具有重要意义。然而，血睾屏障作为哺乳动物的组织屏障之一，也同样阻碍了男性避孕药进入睾丸发挥作用。

研究表明，超过50%的男性有兴趣使用可逆性避孕的方法[6]，许多女性也愿意她们的伴侣使用避孕药[7]。在过去的20年中，激素性避孕药的研发取得了重大进展[8-9]，例如，注射雄激素（十一酸睾酮）、口服雄激素（十一酸二甲雄酮）、睾酮凝胶或雄激素植入物[10-14]，通过升高血清睾酮水平来干扰下丘脑-垂体-睾丸轴，抑制脑垂体分泌黄体生成素，导致间质中的间质细胞产生雄激素减少，从而影响精子发生，由于下丘脑-垂体-睾丸轴被破坏，男性的其他激素依赖的生物功能（如血压）和器官（前列腺）以及肌肉质量都可能受到影响，导致产生副作用和男性的担忧[15-18]，因此开发非激素类男性避孕药是非常有必要的，在不干扰下丘脑-垂体-睾丸轴和血清睾酮水平的情况下，更好地在睾丸中发挥作用。近期关于血睾屏障中药物动力学以及其他新兴技术的研究，为男性避孕药提供新的作用靶点和新前景。

二、血睾屏障的结构和功能

（一）血睾屏障的结构

血睾屏障主要是由支持细胞之间的紧密连接、胞质特化、桥粒和缝隙连接组成的[3-4]，睾丸内的紧密连接与胞质特化共存并共同发挥作用。桥粒和缝隙连接存在于包含紧密连接和基底胞质特化的质膜区域之间。

紧密链接由相邻的支持细胞构成，支持细胞呈锥体形，形状不规则，细胞基部紧贴基底膜，顶部可以到达生精小管的管腔，细胞侧面和腔面凹凸交错，相邻细胞间镶嵌着各级生精细胞，细胞侧面近基部的相邻细胞膜形成紧密连接。紧密连接的膜整合蛋白有许多种类，其中能够调节紧密连接动力学以及能够影响精子发生的蛋白主要有4类：Occludin蛋白、Claudin蛋白、JAMs家族（Junctional adheson molecules）、ZO（Zona Occludens）蛋白[19]。

胞质特化，即睾丸特异的黏附连接，由位于质膜和内质网池之间的六角形排列的丝状肌动蛋白微丝组成。支持细胞之间的外质特化被定义为基底的外质特化，而支持细胞和成形的精子细胞之间的外质特化被定义为顶端的外质特化[20-21]。胞质特化介导的粘附在很大程度上是由钙粘连蛋白-连环蛋白多功能复合体构成的，该复合体还调节肌动蛋白细胞骨架并促进细胞极性[22-23]。

桥粒是介导强力黏附的细胞-细胞连接，而缝隙连接是细胞-细胞通道，允许代谢物、第二信使、离子和其他小于1KDa的分子扩散[24-25]。紧密连接、胞质特化和缝隙连接附着于肌动蛋白微丝[20,26]，而桥粒附着于中间丝[20]。

（二）血睾屏障的功能

1.为生精上皮周期提供不同的微环境：血睾屏障中的紧密连接将生精上皮分隔成基底室和近腔室，基底室靠近基膜，其内有A型精原干细胞（包括Asingle（As）、Apaired（Apr）和Aaligned（Aal）型精原干细胞。）、B型精原细胞以及初级精母细胞（即前细线期精母细胞）。近腔室内，精母细胞接连发生两次减数分裂以发育成精子细胞，最终经过分化形成正常的蝌蚪状精子进入曲细精管管腔。

2.调控各类生物分子的转运：在睾丸中，精子发生所需的营养物质（例如糖类和氨基酸）、重要分子（例如激素和电解质）以及危害精子发生的有害毒物（例如环境、毒物、药物和化学品）都位于生精小管之间的间质。血睾屏障的动态开合可调控这些物质进入减数分裂期和分裂后期的生殖在近腔室内发生形态变化。因此，可为精子发生创建了一个适宜的微环境[1]。

3.构建免疫屏障：确保免疫系统不能识别存在于生殖细胞表面的特异性抗原。最近的研究表明，支持细胞和生殖细胞通过产生干扰素（interferon，IFN）、白介素（interleukins，ILs）和细胞因子来维持独特的防御系统。血睾屏障也阻止免疫球蛋白和淋巴细胞进入近腔室[27-29]。

4.赋予生精上皮极性：血睾屏障通过CRB（Crumbs）-PALS（protein associated with Lin Seven）-PATJ（Pals associated tight junction protein）、PAR3（partitioning defective 3）-PAR6-aPKC、DLG（Scribble Discs large）LGL（Lethal giant larvae）三种细胞极性复合体共同作用，赋予生精上皮细胞极性[30-31]，参与生精细胞迁移，在生精细胞迁移过程中起导向作用，从而保证生精细胞在生精小管内迁移方向的正确性[32-33]。

三、血睾屏障与药物运输

睾丸活体研究中发现，血睾屏障组成中存在药物转运体及几种生物活性多肽。这些结构调节血睾屏障的功能，促进药物通过血睾屏障，这些观点可应用于非激素类男性避孕药adjudin（即1-（2，4-dichlorobenzyl）-1H-indazole-3-carbohydra-zide）的研究[34]。

（一）药物转运体

以男性避孕药adjudin为例，血睾屏障对其生物利用度有显著影响，阻碍了药物从生精上皮的间质间隙转移到腺腔内。这在很大程度上是由于支持细胞在血睾屏障存在强势表达的药物转运体，主要为ATP结合盒（ATP Binding Cassette，ABC）转运体，如P-糖蛋白和多药耐药相关蛋白1（Multidrug Resistance-associated Protein 1，MRP1），它们存在于支持细胞、生殖细胞、管周肌样细胞以及构成间质微血管的内皮细胞的质膜上[1,35-36]。此外，ABC转运体中的乳腺癌耐药蛋白（Breast Cancer Resistance Protein，BCRP）在固有层的管周肌样细胞和间质的微血管内皮细胞中也有很强的表达[35-36]。这些药物转运体均具有外排药物的作用，并且彼此之间协同工作。如果外源性药物以某种方式通过特定的药物转运体（如药物流入泵）穿透血睾屏障，它们就会积极地将外源性药物从睾丸中泵出，阻止药物进入生精上皮，从而限制药物在睾丸中的生物利用度。因此，可以在当前研究的基础上开发出针对药物转运体的制剂，减少药物转运体的“外泵”作用，从而扩大药物疗效。

（二）内源性生物活性肽及其下游信号蛋白

在精子发生过程中通过对顶端胞质特化和基底膜的组成蛋白水解产生几种生物活性多肽，这些多肽可以通过下游信号蛋白有效地调节血睾屏障的功能，促进男性避孕药通过血睾屏障的运输。

第一个是来源于层粘连蛋白-γ3的F5肽[37-38]。F5肽通过干扰支持细胞在血睾屏障上的粘附功能来诱导血睾屏障的重塑[37]，还加强了顶端胞质特化的分解，以促进精子在受精过程中的释放[37-38]。

第二个生物活性肽是NC1（noncollagenous 1）肽，NC1肽通过mTORC1（manmalian torget of rapamycin complex 1）和下游信号转导核糖体蛋白S6（即rpS6）[39]以及抑制Akt1/2（类似于蛋白激梅B）[40]的作用来发挥其功能，从而扰乱纤维肌动蛋白和微管的组织，加速基底胞质特化及顶端胞质特化的退变和重构[40]。

第三个可以调节血睾屏障功能和顶端胞质特化功能的生物活性肽是层粘连蛋白球状域3/4/5（Lg3/4/5）肽，研究表明，Lg3/4/5肽与NC1肽类似，通过mTORC1/rpS6/Akt1/2信号复合体发挥下游作用[41]。

这三种生物活性肽的联合作用使生精上皮中的胞质特化具有可塑性，促进生精上皮中发育的生殖细胞在生精上皮周期中及时运输，并调节血睾屏障的结构和功能。

四、男性避孕药的最新进展

目前，有几个候选化合物正在被研究者们积极研究，其中adjudin和加马达唑似乎是两个很有前景的先导化合物[42]。这两种药物都是氯硝胺的衍生物，已知通过破坏生殖细胞（大鼠睾丸中的第8-19步精子细胞）和支持细胞之间的睾丸特异性非典型粘附连接，即顶端胞质特化，可诱导生精细胞可逆性脱落[43]。根据一项使用adjudin的研究，在雄性大鼠口服adjudin后，只有不到1%的adjudin可以到达睾丸[44]，显示出相对较差的生物利用度，跨血睾屏障运输药物的新发展将有助于开发出新型的非激素类避孕药。

（一）细胞旁入路途径

细胞旁途径指特定物质通过细胞之间的紧密连接进入细胞间隙而被吸收的过程[45]。通过该途径增加药物吸收的研究已取得较大的进展。小干扰RNA（Small Interfering RNA，siRNA）、中链脂肪酸、抗体和多肽等试剂均显示了良好的调节效果[37,46-47]。据报道，许多多肽通过靶向支持细胞整合膜蛋白的胞外结构域来干扰紧密连接的通透性功能。例如，与大鼠Occludin蛋白的第二细胞外环的一段序列相对应的22个氨基酸的肽，已知能在体外和/或体内诱导支持细胞紧密连接屏障的可逆性破坏[48]。

来自层粘连蛋白-γ3链的、被命名为F5肽的生物活性多肽，在睾丸内注射时也能对血睾屏障发挥作用，并加强顶端胞质特化的破坏，从而有效地诱导生殖细胞脱落[37]。F5肽与adjudin联合使用，这种方法可以显着降低adjudin的有效剂量，以提高其生物利用度，该药物在血睾屏障背后发挥避孕作用。更重要的是，F5肽在体外和体内对血睾屏障的破坏性影响是可逆的，其长期健康风险应该是最小的，因为这是一种内源性产生的生物分子[49]。研究表明使用该方法后，大鼠40天足以恢复生育能力[49]。

此外，通过下调紧密连接的整合膜蛋白（如ZO-1、occludin和claudin）的表达来调节血睾屏障通透性。使用特异性siRNA或短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）来提高药物生物利用度，似乎是一种可行的方法。研究表明，在对claudin-5进行siRNA修饰后的[48]小时内，小鼠血脑屏障被短暂和可逆性打开；通过一系列示踪分子实验和磁共振成像（MRI），虽然敲除claudin-5会损害血脑屏障的功能，允许小分子物质透过，但屏障仍然可以形成，大分子的抗精子抗体依旧难以通过，完全发育的成年小鼠没有显示出明显的副作用[50]。因此在未来的研究中可考虑男性避孕药与siRNA链结合的给药方法在血睾屏障中发挥作用。

（二）跨细胞方法

此方法主要是通过增加细胞对药物分子的摄取，从而跨过组织屏障提高生物利用率，具体包括以下几种方法：

1.微粉化技术是最广泛使用的方法，它大大减小了药物颗粒的大小，使药物可以很容易地穿透靶器官的细胞膜。过去十年中超临界流体（SCF）技术被广泛研究。早期的超临界流体技术用于生产粒径约0.7-5.0μm的颗粒。最近的SCF能够获得纳米级的药物颗粒，例如“粒径”＜300nm，从而显著提高不同药物的溶解度和口服生物利用度[51]。使用SCF-CO2方法，可以生产更稳定、更均匀的脂质体，作为更好的药物载体[52]，未来可将几乎不溶于水的adjudin包埋在脂质体中，或利用超临界流体技术制备均匀细小的adjudin微粒，以提高其生物利用度和有效性。

2.反式转录激活因子（TAT）序列，本质是一种11个氨基酸的肽，称为蛋白质/肽转导结构域（Protein/Peptide Transduction Domain，PTD），也被称为细胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs）[53-54]。目前研究认为，药物可通过PTD结合到质膜上，然后通过胞内囊泡介导的内化，将药物释放到细胞胞浆内[54]，类似于血睾屏障中的内吞囊泡介导的转运事件。简而言之，adjudin或其他男性避孕药结合PTD是男性避孕药跨越血睾屏障的一种新的替代方法。

3.此外，纳米技术的发展也为男性避孕药通过血睾屏障带了曙光。纳米粒子的粒径在1～1000 nm，已被广泛运用于输送多种治疗药物，主要作为抗癌药物的载体。传统的药物分子要么连接到纳米粒子的表面，要么包裹到纳米核心中，被运送到靶器官以提高疗效。这些纳米粒子主要设计用来运输水溶性低或容易被酶分解的药物[55]。纳米粒子通常由脂类、金属材料、聚合物、纳米晶体、介孔材料等组成。其中，介孔材料正在成为男性避孕药物的新兴载体。其中研究最多的是介孔二氧化硅纳米粒子（Mesoporous Silica Nanoparticles，MSN）[56]。MSN通过胞内囊泡介导的途径[57]或GTP酶介导的巨噬细胞吞噬进入细胞[58]。给小鼠睾丸静脉注射无定形纳米二氧化硅颗粒，被证明可以穿透支气管束，并导致支持细胞和生殖细胞（例如，精母细胞）中纳米颗粒的积累，而不会造成睾丸损伤[59]。此外，还可以使生物活性药物在到达靶细胞/组织之前不会被酶降解，因为其表面不能被体循环和组织（例如肠道）中的酶所利用[60]。因此，男性避孕药有可能被加载到MSN的六边形排列的中孔中，以供口服，而不需要使用注射，避免了肠外给药，提高了可接受性。

五、总结和展望

我们总结了血睾屏障的相关结构组成和生物学功能，并讨论了非激素男性避孕药如何更好穿越血睾屏障，如药物转运体、生物活性肽以及跨越血睾屏障的新技术，如siRNA和纳米颗粒运输等，这些方法在减少药物副作用和提高药物生物利用度方面都显示出明显的优势。

然而，男性避孕药的临床研发和推广目前仍存在部分挑战。例如，对于不同种族、不同年龄的男性对同一种避孕药的反应是否完全相同；服用避孕药之后的男性停药后是否能够迅速且完全地恢复生育能力；如何安全有效地在临床上进行药物试验。同样的，在保证药物安全有效的前提下，我们仍需要保证药物成本控制在大众可接受范围之内。尽管在未来还有很多问题需要很多研究，但血睾屏障的进展已经为开发新的睾丸给药方法带来了新的曙光。

关键词血睾屏障； 避孕药，男用； 药物释放系统；纳米技术

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2022.02.020

中图分类号R339.211； R698.9； R979.21