m6A RNA 甲基化在肝癌中的作用研究

杨 盈，蒋良君，李 卫

（1.南华大学衡阳医学院，湖南 衡阳 421001；2.南华大学附属南华医院，湖南 衡阳 421002）

据WHO 国际癌症研究机构2020 年的数据统计，原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）在我国恶性肿瘤发病率中位居第5 位，死亡率位居第2 位[1]。尽管可供肝癌患者选择的治疗手段有手术治疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗、介入治疗等，但肝癌早期症状不典型，大多数人发现已处于晚期，此时可选择的治疗方案有限，因此亟需寻找新的生物标志物及治疗方法来提高肝癌的早期诊断和治疗效果，以期改善肝癌的生存率及不良临床结局。近年来，属于表观遗传调控方式的m6A RNA 甲基化在恶性肿瘤方面的作用越来越受到研究者的重视，本文将着重阐述m6A 甲基化相关蛋白组成、作用方式及在肝癌中作用机制的研究进展，为指导肝癌的早期诊断及治疗靶点提供新思路。

1 m6A 甲基化的概念与组成

1.1 概念 m6A RNA 甲基化是真核生物中最普遍的一种RNA 修饰方式，存在超过7000 多个RNA 转录本中，沉积位点主要聚集在编码序列（CDS）、3’非翻译区起始端（3’UTR）及终止密码子附近，主要发生在RRACH 基序上，影响RNA 的转录、剪切、输出、翻译、定位、稳定性等生物学过程[2]。m6A 甲基化被认为是一个动态可逆的过程[3]，可以在时间及空间上以不同形式进行双向调节。甲基转移酶构成m6A甲基化的“作家”（writer），能够促进RNA 的m6A 甲基化作用。去甲基酶则被认为是m6A 修饰过程的“橡皮擦”（eraser），能够逆向调节甲基化过程，发挥去甲基化作用。YTH 结构域家族蛋白被发现能够特异性识别和选择性结合mRNA 非编码区上m6A 甲基化位点，被称作为m6A 甲基化的“读者”（reader）。“作家”“橡皮擦”和“读者”，三者相互作用共同影响m6A 的甲基化过程。

1.2 甲基化转移酶 m6A RNA 甲基化过程主要是通过甲基转移酶复合物（MTC）发挥生物学功能。MTC位于细胞核中，核心成分包括METTL3、METTL14、WTAP。METTL3 与METTL14 以1∶1 化学计量比结合形成二聚体，再与WTAP 结合形成稳定的甲基转移酶复合物，在细胞m6A 沉积位点中发挥作用。METTL 3 是MTC 的主要催化中心，而METTL14 发挥支架作用，不仅使复合物更加稳定，而且还能增强其活性，提高m6A 甲基化效率。WTAP 虽然不具有甲基转移酶活性，但能与METTL3/METTL14 二聚体相结合，影响MTC 活性及在核斑点的定位。

KIAA1429 被认为是MTC 的最大组成成分，作为协调RNA 底物上核心成分的支架，其在3’UTR及终止密码子附近进行特定甲基化。另外有研究表明，RNA 结合基序蛋白15/15B（RBM15/RBM15B）在mRNA 转录组中与甲基化的RRACH 序列相邻，能够结合METTL3-WTAP 复合物，并且被招募到特定位点发挥甲基化作用[4]，也被认为是甲基转移酶。除此之外，研究发现[5]，敲除小鼠胚胎干细胞中的ZC3H13，mRNA 的m6A 水平显著降低，ZC3H13 在细胞核中保留ZC3H13-WTAP-virilizer-hakai 复合物来调节m6A 甲基化，是一个新的甲基化调控因子。另外，有研究新发现[6]，METTL16 能修饰U6 snRNA A43 的m6A 甲基化，属于人类细胞中的一种具有活性的甲基化转移酶，其能够调控细胞内SAM 的稳态。

1.3 去甲基化酶 去甲基化酶主要是由FTO、ALKBH5 组成。FTO 最初被认识是与肥胖、2型糖尿病、BMI 等高代谢疾病密切相关。2011 年在体外实验中发现，FTO 的活性能够影响m6A 去甲基化水平[7]，是第一个被发现的去甲基化酶，该研究也首次证明了m6A 甲基化是一个可逆的动态修饰过程。FTO 属于α 酮戊二酸依赖的双加氧酶ALKB 家族，定位于核斑点。在发现FTO 不久后，ALKBA5 被鉴定为第二种具有生物学功能的去甲基化转移酶，属于非血红素铁（Ⅱ）/α 酮戊二酸依赖的双加氧酶ALKB 家族，表达活性依赖于铁，也定位于核斑点，在大多数生物中表达，与核斑点共定位并影响mRNA 的输出及代谢过程[8]。FTO 和ALKBH5 在恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移、复发、血管生成起着重要作用。大黄酸及一种非甾体抗炎药甲氯芬胺酸（MA），属于FTO 抑制剂[9]，能竞争性结合FTO 位点，抑制FTO的去甲基化水平。未来，可以从FTO 抑制剂着手，通过调控m6A 甲基化水平进而控制肿瘤进展，以为恶性肿瘤的化学药物治疗提供新的靶点。

1.4 识别蛋白 人类基因组中YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2 是目前已知的5 种具有YTH 结构域家族的蛋白，被证明能够特异性识别及选择性结合m6A 甲基化位点，调节mRNA 转录后表达水平，在m6A 甲基化过程中发挥“读者”作用。YTHDF2 是第一个发现并且深入研究的识别蛋白，能够招募前体mRNA 的剪切因子，调节mRNA的剪切和衰变。已有研究表明[10]，YTHDF1、YTHDF2调节m6A 修饰的RNA 翻译过程，并且能够介导其降解；YTHDF3 与YTHDF1 协同在翻译起始阶段发挥重要作用。YTHDC1 和YTHDC2 属于细胞核中的YTH 结构域蛋白，能够影响m6A 修饰的RNA 剪切和核输出过程。YTHDC2 是最大的含YTH 结构的蛋白，具有ATP 依赖的RNA 解旋酶活性，能够正向调控mRNA 翻译[11]。此外，RNA 结合蛋白HNRNP A2B1 被鉴定为另一类核识别蛋白，在体内及体外与核RNA 上包含RGm6AC 的位点结合，与micRNA微处理器蛋白DGCR8 相互作用，介导靶基因的选择性剪切作用[12]。最新研究发现[13]，属于胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白家族（IGF2BPs）的IGF2BP2 能够结合m6A 甲基化位点并发挥识别蛋白作用，维持靶mRNA 的稳定性并防止其降解。

除上述研究相对较多的识别蛋白外，还有FMRP、PRRC2A 等其他的RNA 识别蛋白对RNA 的生物学功能也发挥调控作用，但具体机制及作用还需进一步深入探索。

2 m6A 甲基化与肝癌

2.1 m6A 甲基化促进肝癌上皮间质转化 上皮间质转化（EMT）是上皮细胞失去极性，获得侵袭性，转变为间充质细胞的过程，赋予肿瘤细胞具有癌症干细胞的特性，促进肿瘤的增殖、侵袭、转移及化学耐药等。E-钙黏蛋白E-cadherin 功能的缺失被认为是EMT 的标志之一，snail 蛋白被认为是EMT 转化的诱导剂，启动EMT 过程。Lin XY 等[14]发现，敲除METTL3 能够显著降低肝癌细胞中snail 的表达，减缓癌内转移及上皮间质转化的进展。Li JX 等[15]研究发现转化生长因子-β1（TGFβ1）也是上皮间质转化诱导剂，该研究发现在METTL3 缺失的条件下EMT过程不能被诱导，抑制MEETL3 的水平能够抑制TGFβ1诱导的EMT 过程，m6A 甲基化在该过程中通过阻断TGFβ1二聚体的形成调节TGFβ1mRNA 的衰减及翻译，同时激活TGFβ1因子、促进snail 的翻译，正向调控EMT 过程。

除研究相对较多的METTL3 外，其他m6A 调节蛋白也在EMT 过程中起关键作用。Bian SY 等[16]发现，YTHDF1 与肝癌患者恶性临床病理特征密切相关；敲除YTHDF1 后，EMT 标记物N-cadherin、Vimentin 的表达受到抑制，E-cadherin 上调，YTHDF1可能通过激活AKT/GSK-3β/β-catenin 信号通路和促进EMT 来增强肝癌细胞的增殖、侵袭及转移。总之，snail 蛋白及E-cadherin 的表达水平是EMT 的关键，m6A 修饰调节蛋白可以通过多种方式和不同的分子机制调控snail 及E-cadherin 的表达，从而调控肝癌的EMT。未来，调控m6A 调节蛋白对EMT 关键分子的表达可能会为肝癌的作用机制及治疗靶点的研究提供新方向。

2.2 m6A 甲基化影响肝癌的恶性生物学行为 m6A甲基化调节蛋白通过对目的mRNA 进行m6A 修饰，可以充当原癌基因或抑癌基因，调控肿瘤的恶性生物学行为。METTL3 被发现在人类肝癌中发挥促癌作用，其可通过抑制SOCS2 的表达以m6A/YTHDF2 依赖的方式促进肝癌的增殖及转移[17]。Ma JZ 等[18]研究表明，METTL14 在肝癌组织中低表达，miR-126 是METTL14 的下游靶基因，METTL14与微处理器蛋白DGCR8 相结合，以m6A 依赖的方式正向调节pri-miR-126，促进成熟miR-126 的产生，进一步调控肝癌的转移。目前已有大量关于METTL3 和METTL14 影响肝癌生物学行为不同机制的研究，但WTAP 在肝癌中的作用少有报道，2019 年有研究首次报道了WTAP 在肝癌细胞中表达上调，可影响肝癌的预后。降低WTAP 的表达时，下游靶基因肿瘤抑制因子ETS1 蛋白显著上调；上调WTAP 的表达，其能够以RNA 稳定剂HuR 的方式使ETS1 蛋白转录后抑制，ETS1 以p21/p27 依赖的模式调控WTAP 介导的肝癌细胞周期，从而形成WTAP-HuR-ETS1-p21/p27 轴促进肝癌的进展[19]。此外，Lan T 等[20]研究发现，KIAA1429 在肝癌组织中表达上调，GATA3 是KIAA1429 的直接下游靶点，KIAA1429 能够诱导GATA3 pre-mRNA 3’UTR 上的m6A 甲基化，促使GATA3 pre-mRNA 与RNA 结合蛋白HuR 分离，降解GATA3 pre-mRNA，发挥癌基因作用促进肝癌的进展。

同样，去甲基化酶和识别蛋白通过转录后修饰调控mRNA 的功能，与肝癌的发生发展密不可分。部分研究认为，FTO 作为m6A 的去甲基化酶，在肝癌中上调，与肝癌的不良预后呈正相关。Li J 等[21]研究发现，FTO 在肝癌中发挥促癌作用，敲除FTO 的表达，肝癌的生长及肝癌细胞的增殖受到抑制，并诱导G0/G1期的阻滞。相反，Mittenbühler MJ 等[22]通过研究指出，FTO 充当抑癌基因在肝癌发生中起保护作用，并发现在HCC 启动过程中，FTO 依赖的Cul4a mRNA 去甲基化参与此过程并降低Cul4a 的表达，进而阻断肝癌的细胞周期及增殖。ALKBH5 在肝癌组织中低表达，其调节的m6A 能够被IGF2BP1所识别，通过破坏其下游靶点LYPD1 的表达从而发挥抑制肝癌生长的作用[23]。此外，miRNA145 在肝癌患者中表达下调，miRNA145 能够作用于肝癌细胞中YTHDF2 mRNA 3’UTR 调节m6A 的甲基化水平，从而影响肝癌患者的总生存期[24]。

越来越多的研究显示，m6A 甲基化调控蛋白影响着肝癌的发生发展及复发过程，但目前关于m6A甲基化调控蛋白在肝癌中扮演癌基因或抑癌基因角色具有矛盾性，可能和研究者们采取的实验方法、标本以及标本数量不同有关，其中的具体作用机制值得进一步探索。

2.3 m6A 甲基化参与调控肝癌细胞的肿瘤干性 肿瘤干细胞（CSCs）是指肿瘤中存在一小部分与干细胞有相似生物学作用的未分化的细胞亚群，具有自我更新、多向分化和致瘤能力，是癌症发生增殖、转移、化疗耐药、复发的关键因素。越来越多的证据显示，m6A 甲基化在肿瘤干细胞干性调节中起关键作用，能够促进肿瘤干细胞分化及维持肿瘤细胞多能性。大量研究报道，m6A 甲基化在胶质母细胞瘤[25]、急性髓系白血病[26]、结肠癌[27]、卵巢癌[28]、乳腺癌[29]等中能促进肿瘤干细胞干性及自我更新能力，促进肿瘤的进展。八聚体结合转录因子4（OCT4）最初被证明是调节胚胎干细胞多能性的一种转录因子，在人类癌症及多能干细胞中表达，研究发现Nanog 是OCT4 的下游靶点。Yin X 等[30]发现，OCT4 和Nanog共表达调控着转录激活因子3（stat3）的激活，其主要通过snail 通路来促进肝癌的EMT 及肝癌干细胞干性，影响肝癌的发生发展及不良临床结局。研究表明[31]，在肝癌患者体内，YTHDF2 的表达与OCT4 mRNA m6A 及OCT4 的表达水平呈正相关，YTHDF2 能够调控OCT4 mRNA 5’UTR 的甲基化过程，使OCT4 表达增加，促进肝癌干细胞表型及转移。肝癌干细胞是肝癌进展的关键，m6A 甲基化可以通过调控基因表达介导肝癌干细胞的干性过程，这为揭示肝癌的发病机制及开发靶向药物奠定了理论基础，未来有望通过抑制肝癌干细胞从而抑制肝癌的进展，提高肝癌患者的生存率。

2.4 m6A 甲基化参与肝癌化学耐药 m6A 甲基化在肿瘤耐药及肿瘤微环境中发挥着不可替代的作用。索拉菲尼是美国FDA 批准的用于治疗晚期肝细胞癌的一线用药，可以抑制Raf 激酶、血小板源性生长因子受体、血管内皮生长因子受体等靶点。索拉菲尼能提高肝癌晚期患者的生存率，但容易出现获得性化学耐药，使索拉菲尼的在临床上的应用受到限制。Liang C 等[32]研究发现，在缺氧条件下可观察到索拉菲尼治疗的肝癌细胞存在自噬过程，同时激活了细胞转录应激因子FOXO3a 并诱导其磷酸化及核定位，进而调控缺氧诱导的自噬过程，降低肝癌细胞对索拉菲尼的敏感性。Lin ZY 等[33]基于此研究结果，发现在缺氧环境下消耗METTL3，从而激活FOXO3 信号通路介导的自噬过程，促进肝癌细胞的血管生成及增强索拉菲尼耐药。此外，有研究报道[34]，METTL14 依赖的m6A 甲基化能够介导肝细胞癌患者肝细胞核因子3（HNF3γ）下调，促进肝癌细胞及肝癌干细胞的分化，增加肝癌患者对索拉菲尼治疗的耐药。Xu JJ 等[35]研究发现，属于非编码RNA 的circRNA-SORE 中m6A 水平升高，增加circRNASORE 的稳定性，且在索拉菲尼耐药的肝细胞癌中高表达，能够发挥ceRNA 作用隔离miR-103a-2-5p和miR-660-3p，竞争性激活Wnt/β-catenin 通路，促进索拉菲尼耐药性。这些研究证实了m6A 甲基化参与索拉菲尼耐药机制，后续探索及阐明m6A 甲基化与化学耐药之间的作用机制，可能是改善肝癌患者获得性化学耐药的一种有前景的方向，并为研发逆转肝癌耐药的药物提供了可能。

3 m6A 甲基化在其他肿瘤中的作用

除肝癌外，m6A 在其他恶性肿瘤中也扮演着重要角色。研究发现[36]，METTL3 能够通过上调酪氨酸激酶AXL 翻译水平促进上皮间质转化过程，从而促进卵巢癌的进展。Yue B 等[37]发现，在胃癌患者中，METTL3 表达上调，通过依赖阅读蛋白HuR 信号通路促进其靶点ZMYM1 的mRNA 的表达，招募并结合CTBP/LSD1/CoREST 复合物，抑制E-cadherin 的表达，从而促进胃癌的EMT 过程及胃癌的转移。此外，METTL14 被发现在结肠癌患者中低表达，下调METTL14 能降低下游靶点lncRNA XIST的m6A 水平，使致癌基因lncRNA XIST 表达上调，促进肿瘤的生长和转移，该实验还发现lncRNA XIST 的m6A 甲基化过程能被YTHDF2 识别，介导XIST 的降解[38]。

4 总结与展望

近年来，RNA 的表观遗传学在肿瘤学中的作用逐渐成为研究热点，m6A 属于RNA 表观遗传修饰的一种，参与细胞生物学的各种过程。肝癌在我国属于高发肿瘤，恶性程度及死亡率极高，严重影响着患者的生存周期及生活质量，寻找新的诊断标志物及治疗方案是目前亟需解决的问题。目前大量研究已表明，m6A 修饰在肝癌进展过程中起着不可或缺的作用，但相关调节蛋白的具体作用及作用机制尚未完全明确，且有些调节蛋白在同一肿瘤中扮演抑癌或致癌双重身份，未来需要进一步去探索其具体作用，以为肝癌的早期诊断及晚期治疗提供更多的可能性，期望未来研发出靶向治疗药物提高肝癌患者的生存率及生活质量。