柑橘果实中酚酸类化合物研究进展

徐程楠 王天玉 姚周麟 张伟清 冯先橘 林 媚

（浙江省柑橘研究所 台州 318026）

柑橘是世界上种植最多的水果之一，广泛地分布于热带、亚热带和温带区域，主要包括甜橙类、宽皮柑橘类、葡萄柚和柚类、柠檬类、杂柑类和金柑类等[1]。我国是世界柑橘生产大国，2019年柑橘种植面积为2.61×106hm2，产量高达4.58×107t[2]。我国柑橘类水果消费以鲜食为主，部分以罐头、果汁形式进行加工。柑橘果实中富含对人体健康有益的活性成分和抗氧化物质如维生素、矿物质、酚类、萜类等[3]。酚酸类化合物是其中普遍存在的次生代谢产物，是酚类物质其中一类，其在植物体内主要由糖酵解及磷酸戊糖途径生成的中间体经莽草酸途径和苯丙烷类代谢途径合成[4,5]。大量研究表明酚酸类化合物对人体具有抗氧化、抗癌、抗菌等功效。因此，明确柑橘果实中酚酸类化合物的组成、分布、生物活性以及提取检测方法，以期实现柑橘果实的针对性开发利用，提高其附加值，同时，为合理利用柑橘资源、丰富柑橘营养与保健研究提供参考依据。

1 柑橘果实中酚酸类化合物组成与分布

酚酸类化合物[6]是指同一苯环上含有若干酚羟基的一类化合物，其在柑橘组织中主要以有机酸、糖类以及各种酯类形式存在，极少部分为游离态。按其碳骨架结构主要可分为苯甲酸型（C6-C1型）和肉桂酸型（或苯乙烯型，C6-C3），但也有如绿原酸和香草醛等少部分酚酸结构不属于上述两类衍生物[7]。据徐贵华等[8]对不同成熟期蜜橘中酚酸的组成研究表明柑橘果实中酚酸类化合物结构以肉桂酸型为主，苯甲酸型含量较少。目前可检出的酚酸类化合物[9,10]主要为：（1）肉桂酸型：咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、芥子酸、苯乙烯酸；（2）苯甲酸型：原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、没食子酸、丁香酸、水杨酸、龙胆酸；（3）其他：绿原酸等。

柑橘果实中酚酸类物质的组成及含量随成熟度变化而不同，董昕颖[11]分析了不同采收期尤力克柠檬果实的营养品质，结果表明酚酸总体含量随成熟度增加而下降，且果肉与果皮中酚酸含量达到最高的时期，分别为4月和6月。徐桂华等[8,12]对不同成熟期温州蜜橘、椪柑和胡柚的酚酸组成与分布进行了研究也得到类似结论，酚酸含量在果肉中随成熟度提高而减少，而果皮在半成熟期达到最高；此外，随着成熟度提高，果实中自由酚酸含量则持续下降，其中绿原酸和阿魏酸在检出的酚酸中含量最高。

同时，酚酸类化合物在柑橘果实各部位间分布也存在较大差异，一般而言果皮中酚酸含量高于果肉和种子，其在柑橘果皮中主要以可溶性酚酸形式存在，且肉桂酸型含量高于苯甲酸型，以阿魏酸和芥子酸为主[13]。Xi等[14]发现5个柠檬品种果实中咖啡酸在不同部位含量趋势大致为果皮＞全果＞果肉＞果汁＞种子，绿原酸含量则为果皮＞全果＞种子＞果肉＞果汁，果皮中没食子酸含量最高，阿魏酸仅在果皮、全果和种子中有检出。柚果实中酚酸总体含量果皮高于果肉，且黄皮层中以对香豆酸、阿魏酸和芥子酸为主，白皮层中酚酸组成相似但含量相较更低，而果肉中则以芥子酸、阿魏酸和香草酸为主[15]。然而对9个中国主栽葡萄柚品种果实不同部位酚酸组成的研究结果则与上述结论有所差别，主要酚酸为没食子酸，果实各组织间亦存在显著差异，依次为果肉＞黄皮层＞白皮层＞嚢衣＞种子[16]。

由此可见，不同柑橘品种果实所含酚酸物质的种类和含量亦不相同，Chen等[17]通过对52个柑橘品种比较发现其果皮中主要酚酸为苯甲酸和原儿茶酸，不同种类柑橘总酚酸含量差异明显，宽皮柑橘类相较橙类、柚类、柠檬类和金柑类含量最低。郑洁等[18]报道了柑橘果皮果肉中酚酸含量以砂糖橘最多，椪柑、柠檬、鸡尾葡萄柚和纽荷尔脐橙次之，金柑最少，果皮中酚酸含量是果肉中的3～5倍，绿原酸和阿魏酸为主要酚酸。张静等[19]利用超高效液相色谱分析了9种晚熟柑橘中7种主要酚酸，其含量和种类也存在明显差异，果汁中为春见的咖啡酸含量最高，果肉中为沃柑的阿魏酸、咖啡酸、芥子酸和塔罗科血橙的对香豆酸含量最高，果皮中则为默科特的阿魏酸含量最高，就大类而言杂柑类果皮中咖啡酸、阿魏酸含量高于橙类。

2 酚酸类化合物的生物活性

2.1 抗氧化活性

柑橘酚酸结构中含有若干酚羟基故具有较强的供氢能力，其能清除因机体衰老、损伤而产生的过氧自由基、羟自由基等，是一类天然的抗氧化剂[20]。众多研究表明柑橘酚酸的抗氧化能力主要受其结构和所在溶液的极性影响[21-23]，苯环上取代的羟基数量越多其抗氧化能力则越强。羟基数量相同时，其抗氧化能力则取决于羟基取代位置引起的空间位阻大小；当以上两者都相同时，肉桂酸型抗氧化能力强于苯甲酸型。另外，酚酸的自由基清除机理因溶液极性变化也有所不同，在极性溶液中为质子伴随的电子转移反应，在非极性溶液中则为抽氢反应，故其抗氧化能力也存在差异。Paulo等[24]报道了10～40 μg/mL浓度范围内的阿魏酸可保护真皮层纤维细胞免受紫外线辐射导致的DNA氧化损伤[25]；p -香豆酸可通过提高糖尿病大鼠肝脏内源性抗氧化能力(谷胱甘肽-谷胱甘肽水平)抑制氧化应激的发生[26]；此外，Kikuzaki等[27]评估了不同肉桂酸型酚酸在体外的自由基清除能力，其抗氧化活性以咖啡酸、芥子酸、阿魏酸、p -香豆酸顺序依次减弱。

2.2 抗癌活性

柑橘果实中的酚酸类物质对肿瘤细胞生长抑制作用明显，极具抗癌潜力，其主要抗癌机制如下：抑制基因毒性分子的形成，阻断诱变转化酶的活性；调节含血红素I相酶，抗癌解毒II相酶，并阻止DNA加合物形成[28]。学者们报道了咖啡酸、阿魏酸、香草酸等酚酸可抑制如乳腺癌、结肠癌、肺癌等多种癌细胞的增殖[29]。Russo等[30]研究表明日常膳食中羟基苯甲酸和咖啡酸的摄入量越多越能降低前列腺癌转变为晚期的风险，增大咖啡酸和阿魏酸的摄入量可能与降低患前列腺癌风险有关。酚酸类物质除可抑制肿瘤细胞生长外还能减少其转移，如在大鼠饲料中添加咖啡酸，可减少肝癌细胞在肝脏的转移[31]。另有研究指出没食子酸及其衍生物对机体内非肿瘤细胞的细胞毒性较低，而对包括白血病、黑素瘤、肺癌和乳腺癌等恶性肿瘤细胞系表现出更强的选择性细胞毒性，且其抗癌活性因细胞类型而异，可能受其诱导细胞凋亡机制不同所致[32]。

2.3 抗菌活性

酚酸类化合物还具有较强抑菌活性，其抑菌能力与结构中取代基长度、不饱和程度以及浓度等有关。此外，酚酸类物质与芳香族等其他物质同时存在时具有协同作用，可显著增强酚酸的抑菌活性[20]。阿魏酸、没食子酸可有效抑制大肠杆菌、铜绿假单胞菌和单核增生李斯特菌[33]。朱金帅等[34]比较了没食子酸、原儿茶酸和绿原酸对水产品中腐败希瓦氏菌的抑制活性，结果表明3种酚酸中没食子酸对腐败希瓦氏菌的抑制能力最强，经1.25 mg/mL的没食子酸处理，腐败菌形态明显改变，细胞膜遭破坏，膜内物质大量外泄，细胞凋亡率增高。酚酸间抑菌能力也具有协同作用，以阿魏酸和香豆酸为例，相较单独使用，其最小抑菌浓度可降低1.5～3倍；酚酸类化合物在致病菌细胞内会通过触发亚铁离子反应途径等造成胞内氧化还原失衡，促进过氧化物产生，导致细菌过氧化损伤而死亡，该过程与抗生素灭菌机理类似，例如香豆酸杀灭金黄葡萄球菌[35]。除致病菌外，在一定程度上酚酸对益生菌、共生菌都有抑制作用，Cueva等[36]评估了13种酚酸对大肠杆菌、乳酸菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的抑菌活性，致病性大肠杆菌O157∶H7最为敏感可被其中10种酚酸抑制，除铜绿假单胞菌最不敏感外，其他菌的生长也受到不同程度的抑制。

2.4 其他生物活性

炎症是机体应对刺激、损伤等产生的保护反应，绿原酸可通过抑制一氧化氮、前列腺素、促炎细胞因子和黏附分子等各种炎症介质的表达来实现抗炎目的[37]；没食子酸则是通过抑制NF-κB通路激活在溃疡性结肠炎中发挥抗炎作用[38]；香草酸具有镇痛和抗炎作用，该作用依赖于对中性粒细胞、氧化应激反应、细胞因子以及NF-κB通道的抑制[39]。另有医学研究指出咖啡酸及其衍生物对乙酰胆碱酯酶有明显的抑制作用，而乙酰胆碱酯酶是一种与阿尔茨海默症发病有关的酶[40]。p-香豆酸则可作为酪氨酸酶的竞争性抑制剂，抑制人表皮黑素细胞中黑色素合成，作为一种美白活性成分在美白护肤行业中有很好的应用前景[41]。此外，不少研究表明阿魏酸、没食子酸等酚酸具有神经保护功能[42]；柑橘酚酸还可舒缓血管，预防高血压，Fraga等[43]发现长期摄入橙汁可降血压和降体脂，该功效部分原因归功于其中的酚酸组分。

3 柑橘果实中酚酸的提取及检测

3.1 柑橘酚酸提取方法

目前相关文献报道的柑橘果实中酚酸类物质的提取方法[44]主要有：传统溶剂萃取法、超临界二氧化碳萃取法、流体萃取法、超声波辅助萃取法、微波辅助萃取法以及酶辅助萃取法等。其中传统溶剂萃取法是最常用的方法，主要通过改变有机溶剂种类、浓度、温度、提取时间以及提取次数。Chen等[45]，发现较高的温度(100℃)下进行干燥获得酚类物质含量和抗氧化活性更高。相较传统溶剂法，其他萃取方法更环保，所需能源和溶剂更少，同时有更高的产量。Hayat等[46]比较了用微波辅助提取，超声波辅助和加热回流提取法的效果，结果表明微波辅助萃取法对游离、酯化、糖苷化和不溶性四种形态的酚酸提取效率高、提取时间短、抗氧化活性强。柑橘果实中酚酸多以结合态形式存在，必要的外源酶可将其从组织中释放，提高萃取产量，Nishad等[47]比较了酶辅助萃取法与超声辅助萃取法对马耳他甜橙果皮废弃物中酚类物质的提取效果，采用酶辅助萃取法的酚类物质含量增加2倍，且更绿色环保。

3.2 柑橘酚酸类物质的检测技术

现阶段柑橘果实中酚酸类物质的主要检测技术有光谱分析、毛细管电泳、色谱分析、电化学分析、核磁共振等[20,48]。其中光谱分析法和色谱分析法是最为常用的方法，光谱分析法是根据酚酸类物质对光的选择性吸收而进行定性定量分析的，利用傅里叶变换红外光谱可测定冷冻干燥柠檬汁中总酚含量，该方法可替代传统福林酚法，更经济、省时[49]。Chen等[50]首次建立了一种高效液相色谱结合二极管阵列检测器方法用于同时检测柑橘和葡萄中绿原酸、咖啡酸等16种酚类物质，检测准确、快速，回收率高，精密度好，检测限为 0.03～1.83 μg/mL，定量限为0.09～5.55 μg/mL。超高效液相色谱联用三重四极杆质谱可同时检测柑橘果实中11种酚酸和类黄酮，检测快速、灵敏，仅需11min[51]。此外，学者们还致力开发更灵敏、便捷的酚酸检测方法，Ghaani等[52]报道了利用纳米银/飞燕草素修饰玻碳电极用于高灵敏检测没食子酸的电化学方法，检测限低至0.28 μ M，并在0.60～8.68 μM和8.68～625.8 μM两个浓度范围内可实现对没食子酸的定量检测；核磁共振技术也被报道用于中国甜橙中水杨酸等成分的快速定量与产地溯源[53]。

4 总结与展望

目前国内外学者对柑橘中酚酸化合物的研究主要集中在生物活性、检测技术及提取方法的开发，但对多种酚酸类物质间的协同或拮抗作用尚处探索阶段，且亟待开发除色谱分析方法外的检测技术，对其中酚酸类物质的组成、活性等特性研究不够充分。柑橘果实中酚酸化合物含量和种类丰富，约占总酚含量的1/3，主要分布于果皮中，是重要的酚酸来源，然而除陈皮等少部分可用于入药外对其利用研究较少，建议探索其活性用途，提高其生物利用率，不断优化提取制备工艺以实现产业化应用。